响应面优化法提取玫瑰花渣多糖的工艺研究

勾明江，许子竞, 刘 茜

(1.2.贵州工程应用技术学院 天然产物中心，贵州 毕节 551700；3.梧州学院，广西 梧州 543000)

响应面优化法提取玫瑰花渣多糖的工艺研究

勾明江1，许子竞2, 刘 茜3

(1.2.贵州工程应用技术学院 天然产物中心，贵州 毕节 551700；3.梧州学院，广西 梧州 543000)

该文以玫瑰花渣为原料，利用响应面法对玫瑰花渣多糖的提取工艺条件进行优化。在单因素实验的基础上，选取提取温度、提取时间、液料比为影响因子，以多糖得率为响应值，根据Box-Behnken 中心组合实验设计原理，采用3因素3水平的响应面分析法，建立二次回归模型，研究各变量交互作用及其对玫瑰花渣多糖提取得率的影响。结果表明，通过方差分析可知各因素对玫瑰花渣多糖提取得率影响的大小依次为提取温度、时间、料液比。玫瑰花渣提取多糖的最佳工艺条件为：浸提温度82℃、浸提时间37 min、料液比1∶26(g/mL)，在此条件下玫瑰花渣多糖提取得率可达1.585%，与模型预测值1.592%高度相符。

玫瑰花渣多糖；响应面分析法；提取；优化

玫瑰花(rose flower)是多年生灌木蔷薇科植物玫瑰(rosa rugosa thumb)的干燥花蕾,在我国有两千多年的栽培及药用历史[1-2]。玫瑰花是提取玫瑰精油的原料。玫瑰花经蒸馏挥发油后剩下大量的玫瑰花渣[3]；研究发现，玫瑰花渣中营养成分和功效成分十分丰富，如含有微量元素、蛋白质、糖类、黄酮 (花色素、槲皮素)、有机酸、生物碱、鞣质、酚类等多种成分，因此玫瑰花渣具有很高的再利用价值[4-5]。目前，国内外对于玫瑰花的研究比较广泛，但对玫瑰花渣的研究较少，尤其是具有生物活性的玫瑰花渣多糖(rose flower dregs polysaccharides ,RFDP)研究更少。本试验利用超声波辅助提取玫瑰花渣中的多糖[6-8]，并通过响应面法对提取工艺进行优化[9]，为进一步开发玫瑰花渣资源提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

玫瑰花由贵州毕节市撤拉溪乡玫瑰种植合作社提供；纯化水(实验室制备)、丙酮、无水乙醇、甲醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等，均为分析纯。

1.2 主要仪器

TDL-5C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；2102PCS紫外-可见分光光度计：尤尼科(上海)仪器有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；旋转蒸发仪(BSZ-100B)：上海亚荣生化有限公司。

2试验方法

2.1 玫瑰花渣多糖提取工艺流程

玫瑰花→蒸馏玫瑰油→ 玫瑰花渣→称重(计算干重)→超声波辅助纯化水提取3次→合并提取液→浓缩至体积的1/3→离心→离心液→苯酚-硫酸显色→紫外光下检测吸收峰值→计算提RFDP的提取得率。

2.2 工作曲线和回归方程

精密称取标准葡萄糖白色粉末0.0500g至500 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀待用。分别吸取上述葡萄糖标准液(100μg/mL) 1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL到10mL容量瓶中，加水定容，然后分别移取1mL于7支试管中，各加入5%苯酚溶液1mL和4mL浓硫酸，充分摇匀，静置30min ,冷却至室温。以蒸馏水为参比，在UV490nm波长处测各管的Abs值，以葡萄糖浓度C为横坐标，以吸光度值A 为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为A =0.0106C+0.1472，R2=0.9995。

2.3 样品中多糖化合物含量的测定

准确称取样品2.000g于250 mL三角瓶中，超声提取3次，抽滤，合并滤液，定容至100 mL 容量瓶中，摇匀。移取25 mL于50 mL的容量瓶中进行稀释2倍，玫瑰花渣多糖类化合物的产率计算为：

多糖产率/% =C×D×f÷W× 100

式中：C为供试液中葡萄糖浓度，mg/mL；D为多糖的稀释因素，mL；f为换算因子；W为供试玫瑰花渣样品的重量，mg。

3结果与讨论

3.1 RFDP提取的单因素试验

影响RFDP提取的因素很多，本试验主要讨论提取温度、时间和料液比三因素对RFDP提取得率的影响。

3.1.1 时间的影响

图1 时间对RFDP提取得率的影响

固定提取温度80℃、料液比1:20(g/mL)，研究时间对RFDP提取得率的影响。从图1可知，时间对RFDP的提取得率有明显的影响，从20min～35min，RFDP的提取得率上升较快，而从35min后提取得率几乎不变，说明提取35min比较适宜。

3.1.2 温度的影响

图2 温度对RFDP提取得率的影响

固定提取时间35min、料液比1:20(g/mL)，研究温度对RFDP提取的影响。从图2可知，温度对RFDP的提取得率的影响比较显著，从65℃～80℃，RFDP的提取得率达到最大，而从80℃后提取得率开始略有下降，说明80℃提取较适宜。

3.1.3 料液比的影响

固定提取温度80℃、提取时间35min，研究料液比对RFDP提取的影响。从图3可知，料液比从1:10(g/mL)提高到1:25(g/mL)，RFDP的提取得率逐渐升高，而随着料液比增加，RFDP的提取得率几乎不变，说明料液比在1:25(g/mL)时，RFDP的提取较适宜。

图3 料液比对RFDP提取得率的影响

3.1.4 提取次数的影响

批次料以提取温度75℃、时间16min，第1次提取料液比1:6，后3次提取料液比1:4，提取3批次，每批次提取得率如表1。

表1 提取次数对RFDP提取得率的影响

提取批次批次料提取次数提取得率%1234总提取得率%第4次提取占总提取得率百分比%11.020.340.210.0111.5810.6921.010.350.220.0031.5830.1931.000.340.240.0061.5860.38

由表1可知，批次试验中，提取得率随提取次数增加，提取得率逐渐减少，第4次提取得率占批次料总提取得率<1%，说明试验每批次料提取3次比较合适。

3.2 响应面分析法对RFDP提取工艺的优化

3.2.1 响应面分析因素的选择

运用SAS 8.1软件程序，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[9-10]，综合上面单因素的实验结果，以提取温度、提取时间和料液比为三影响因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表2。

表2 响应面分析因素与水平

因素水平-101时间(Z1/min)253545温度(Z2/℃)758085料水比(Z3/g/mL)1:201:251:30

3.2.2 响应面分析

分别对提取时间(X1)、提取温度(X2)和料液比(X3)作变换：设X1= (Z1-35) /10，X2= (Z2-80) /5，X3= (Z3-25) /5，以X1、X2、X3为自变量，RFDP的提取得率为响应值(Y)，试验方案及结果如表3,回归模型方差分析及模型系数显著性检验如表4。

表3 Box-Behnken中心组合设计方案及试验结果

序号编码值真实值X1X2X3时间/min温度/℃料液比(g/mL)吸光度提取得率/%1-1-1025751∶250.6121.1272-11025851∶250.7151.42831-1045751∶250.6361.387411045851∶250.7201.45850-1-135751∶200.6231.28260-1135751∶300.6261.356701-135851∶200.7251.515801135851∶300.7301.5179-10-125801∶200.6151.3281010-145801∶200.7201.48911-10125801∶300.7081.4001210145801∶300.7451.5071300035801∶250.7551.5651400035801∶250.7511.5641500035801∶250.7571.567

表4 回归模型方差分析及模型系数显著性检验

方差来源自由度平方和均方F值P值显著性X110.03890.03891295.910.0001***X210.07330.07332442.100.0001***X310.00340.0034114.690.0001***X1X110.03760.03761252.040.0001***X1X210.01320.0132440.340.0001***X1X310.00070.000724.270.0043**X2X210.04830.04831609.430.0001***X2X310.00130.001343.150.0012**X3X310.00410.0041137.280.0001***总回归90.21200.0236784.410.0001***失拟差30.00010.000120.780.046*总残差50.00020.00003总离差140.2122R2=99.80%R2adj=99.93%

注∶*P<0.05，表示差异显著；**P<0.01，表示差异非常显著,* * *P<0.001，表示差异极显著。

表3中，1～12是析因试验，13～15是中心试验。15个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点重复3次，用以估计试验的误差。用SAS RSREG程序对所得数据进行回归分析，分析结果见表4，响应面和等高线图见图4、图5、图6。各因素经回归拟合，得回归方程：

Y1=1.57+0.0698X1+0.0958X2+0.0208X3-0.1009X1X1-0.0575X1X2- 0.0135X1X3- 0.1144X2X2-0.018X2X3-0.018X3X3

(1)

从表4回归分析可以看出，模型回归差异极显著。一次项X1、X2、X3对RFDP提取得率的影响极显著，三因素影响顺序为X2>X1>X3(以P值及F值的大小判断)，二次项X1X1、X2X2、X3X3对RFDP提取得率的影响极显著，交互项X1X2对RFDP提取得率的影响极显著，X1X3、X2X3对RFDP提取得率的影响非常显著。回归方程的F值为784.41，P<0.001，且失拟误差的P值为0.046，显著，这说明，利用响应面法拟合得到的试验模型极显著，按照拟合模型得到的回归方程，考察其因变量与自变量之间的线性相关系数，r= 99.80% / 99.93% = 0.9987，表明用该数学模型来评估各相关因素对RFDP提取得率的影响可信度较高。

图4 Y = f (X1、X2)的响应面与等值线图

图5 Y = f (X1、X3)的响应面与等值线图

图6 Y = f (X2、X3)的响应面与等值线图

图4—图6直观地反映了各因素对响应值Y的影响，给出了各个因子交互作用的响应面的3D和等值线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选的范围内存在极值，既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。

为了进一步确定最佳点的值，对回归方程取一阶偏导数得：

0.0698- 0.2018X1-0.0575X2-0.0135 X3= 0

(2)

0.0958-0.0575X1-0.2288X2-0.018X3= 0

(3)

0.0208- 0.0135X1-0.018 X2-0.036X3= 0

(4)

解方程组得：X1= 0.2357，X2= 0.3458，X3= 0.1697 代入方程(1)得：Z1= 37.357，Z2= 81.729，Z3= 25.849，即RFDP的最佳提取时间：37.357 min，提取温度：81.729℃，料液比：1:26.849，在此条件下，RFDP的理论值可达1.592%。

考虑到实际情况，将最佳条件修正为提取时间37min，提取温度82℃，料液比1:26，RFDP的提取得率为：1.585%。

4结论

本实验以水为溶剂，超声波辅助提取玫瑰花渣多糖，探索了提取温度、提取时间、液料比对玫瑰花渣多糖得率的影响，经单因素和响应面试验，得出玫瑰花渣多糖的最佳工艺为: 提取温度82 ℃、提取时间37min、液料比1:26(g/mL) ，玫瑰花渣多糖的得率为31.585%，与预测值1.592% 高度相符，并得到玫瑰花渣多糖得率与提取各因素变量的二次方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，说明模型方程能很好地反应真实的试验值，有一定应用价值。

[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：化学工业出版社，2005.

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[4] 尉芹，王永红，胡亚云，等. 玫瑰花渣化学成分与营养成分研究[J].林学院学报，2005，20(3)：140-141.

[5]郭英，高云.玫瑰花渣总黄酮清除活性氧自由基及体外抗氧化活性研究[J].微量元素与健康研究，2014(2)：1-3.

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[11]Box G E P, Hunter W G.Statistics for Experiments:An Introduction to Design,Data Analysis and Model Building[M].New York:Wiley,1900.

(责任编辑：覃华巧)

Study of the Extraction Technique of Rose FlowerDreg Polysaccharide by Response Surface Methodology

Gou Mingjiang1, Xu Zijing2, Liu Qian3

(1.2. Center of Natural Products, Guizhou University of Engineering Science, Bijie 551700, China;3. Wuzhou University, Wuzhou 543002, China)

Optimization of technique of extracting polysaccharides from rose flower dregs by response surface methodology has been conducted. On the basis of single factor experiment, taking extraction temperature, extraction time and ratio of solid to liquid as factorial parameters, taking polysaccharide yield as the response value, employing Box-Behnken Design (BBD) and response surface methodology(RSM) of three-factor-three-level test，a mathematical regression model was established to study the interaction the variables and their impact on extracting rate of rose flower dreg polysaccharide. The results indicate importance of three process parameters affecting extraction yield of polysaccharides is in the ranking of extraction temperature, extraction time and ratio of solid to liquid. The optimum extraction conditions of polysaccharides from rose flower dregs are as follows: extraction temperature of 82℃, extraction time of 37minutes and ratio of solid to liquid of 1:26 (g/ml). The extraction yield of polysaccharides of rose flower dregs could be up to 1.585%, exhibiting a good agreement with the predicted values of 1.592%.

Rose flower dreg polysaccharides (RFDP); Response surface methodology (RSM); Extraction; Optimization

2016-09-26

贵州省科技厅、市科技局学校联合基金(LH[2016]7059)；贵州省毕节市2016年科学发展计划基金([2016]32)

TQ914.3

A

1673-8535(2016)06-0037-08

勾明江(1994-)，男，贵州毕节人，贵州工程应用技术学院化工程学院本科生。

许子竞(1970-)，男，江西临川人，贵州工程应用技术学院化工程学院天然产物中心副教授，研究方向：天然产物提取与分离。

刘茜(1975-)，女，广西梧州人，梧州学院机化学院讲师，研究方向：天然产物提取与分离。