青蒿琥酯对颚部小涎腺腺样囊性癌细胞系增殖侵袭能力及SP1蛋白表达的影响

陈宇麟，陈　虎，李佳荃，农晓琳

(广西医科大学1.口腔医学院口腔颌面外科；2.医学科学试验中心，广西 南宁　530021)



青蒿琥酯对颚部小涎腺腺样囊性癌细胞系增殖侵袭能力及SP1蛋白表达的影响

陈宇麟1，陈虎1，李佳荃2，农晓琳1

(广西医科大学1.口腔医学院口腔颌面外科；2.医学科学试验中心，广西 南宁530021)

摘要：目的探索青蒿琥酯(ART)对人颚部小涎腺腺样囊性癌(NACC)细胞增殖、侵袭能力的影响。方法用MTT法检测经37.5、150、600 μmol·L-1ART干预24、48 h后，NACC细胞体外增殖水平的变化；Transwell法检测37.5、150、600 μmol·L-1ART干预48 h后，NACC细胞体外侵袭能力的变化；Western Blot法检测ART干预48 h后，NACC细胞中转录因子SP1蛋白表达水平的变化;各实验方法均设立空白对照组及5 μmol·L-1顺铂(DDP)阳性对照组。结果与对照组比较，ART作用于NACC细胞24 h时即表现出对其增殖能力的抑制作用(F=12.071，P<0.001)，作用时间延长至48 h时，抑制作用更加明显(F=169.098，P<0.001)；Transwell实验中，与对照组相比，37.5、150、600 μmol·L-1ART组穿膜细胞数量明显减少(F=139.939，P<0.001)；Western Blot实验结果显示：与空白对照组相比，37.5、150、600 μmol·L-1ART及5 μmol·L-1DDP阳性对照组中SP1蛋白表达水平均出现不同程度的下降(F=200.998，P<0.001)。结论青蒿琥酯可以有效抑制NACC细胞体外增殖及侵袭能力，并下调转录因子SP1表达，二者间可能存在联系。

关键词：青蒿琥酯；腺样囊性癌；增殖；侵袭；转录因子；SP1

Influence of Artesunate on proliferation, invasion ability and the

expression levels of SP1 protein of novel human palatal salivary

gland cell line of adenoid cystic carcinoma

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是一种好发于涎腺的恶性肿瘤，具有生长相对缓慢，有嗜神经侵袭、易沿血管侵袭扩散的特性，在癌变的早期即可发生转移。单纯通过手术治疗难以彻底切除癌变组织，治疗后很容易复发，且伴有极高的远处转移率，长期预后效果不佳。化疗是临床治疗ACC的重要组成部分，特别是针对发生转移之后，化疗更是成为了主要的治疗手段。青蒿素是从黄花蒿中分离出来的化合物[1]，是一种高效、低毒的抗疟药[2]，近年来的研究表明[3-4]，青蒿素及其衍生物不仅在治疗疟疾方面卓有成效，在抑制肿瘤的方面也表现出了值得关注的潜力。本课题组前期使用青蒿琥酯(ART)对人源颚部小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系进行了体外干预，发现青蒿琥酯在体外可以促使NACC细胞凋亡、抑制其迁移能力[5-6]。为进一步探明青蒿琥酯对腺样囊性癌的作用，本实验研究拟从该药抑制肿瘤细胞增殖、侵袭能力。和对转录因子SP1的影响方面入手，做进一步探索。

1材料

1.1细胞株腺样囊腺癌细胞株NACC由课题组前期原代培养并稳定传代获得[7]。

1.2试剂与药物RMPI-1640细胞培养基(杭州四季清公司)；四甲基氮唑盐MTT(美国SIGMA)；二甲基亚砜DMSO(北京Solarbio)；SP1一抗浓缩型，荧光二抗(英国Abcam)；Matrigel基质胶( 美国BD 公司)；细胞培养瓶(美国Corning,底面积为25 cm2);96孔板，Transwell小室(美国Costar，膜孔径为8 μm)；顺铂注射液(江苏豪森药业股份有限公司)；注射用青蒿琥酯(广西桂林南药股份有限公司)。

1.3主要实验仪器CO2培养箱(日本SANYO)；酶标仪(美国BIO)；CKX41 型倒置相差显微镜(Olympus) NanoDrop200-型Thermo紫外分光光度计 (Thermo)；台式高速低温离心机(Eppendorf公司)；电泳仪(美国BIO-RAD)；Odyssey双色红外荧光成像系统(美国LI-COR公司)。

2方法

2.1细胞的培养腺样囊腺癌细胞株NACC生长于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的RMPI-1640细胞培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞生长接近80%汇合度时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.2四甲基氮唑盐(MTT)法检测青蒿琥酯对NACC细胞增殖的抑制作用收集对数生长期的各组细胞, 以0.25%胰酶消化, 计数, 接种于96 孔培养板内, 使每孔细胞密度为5 000个,置于37℃、5%CO2培养箱中24 h，换含有37.5、150、600 μmol·L-1ART和5 μmol·L-1DDP的无血清培养基培养20 、44 h，以不含药物的无血清培养基为空白对照。每孔加20 μL MTT，继续孵育4 h，弃培养液。接着每孔加150 μL DMSO，震荡10 min，每个浓度设置3个复孔，用酶标仪测定每孔吸光度值，实验重复3次。

2.3Transwell细胞侵袭实验检测青蒿琥酯对NACC细胞侵袭能力的抑制作用在Boyden小室下室加入含10%FBS的RPMI-1640培养基作为趋化因子, 上下室之间由聚碳酸酯微孔滤膜隔开(直径13 mm 、孔径8 μm), 膜上均匀铺每孔60 μL/的人工基底膜胶(Matrigel , BD 公司),37℃温箱聚合30 min。将NACC细胞按照1×105个每孔，接种于六孔板中，待NACC细胞处于对数生长期时用含37.5、150、600 μmol·L-1ART和5 μmol·L-1DDP的完全培养基干预48 h，以不含药物的完全培养基作为空白对照，干预完成后用0.25%的胰酶消化收集细胞，计数并重悬，每组取细胞悬液400 μL(2 ×104个细胞)加入上室,于37℃, 5%CO2条件下培养24 h。吸弃上室液体，擦去小室膜内表面未侵袭的细胞及Matrigel胶,每个小室加入200 μL PBS液漂洗，弃去PBS后，用4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色。每组设3个平行样本，随机计数5个400倍显微视野下的穿膜细胞数, 计算平均值, 进行统计学分析，实验重复3次。

2.4蛋白印迹法检测青蒿琥酯对SP1蛋白表达的影响分别收集用上述药物干预后的细胞，用蛋白裂解液处理之后离心取上清，加入蛋白上样缓冲液混匀后煮沸15 min，分别取各组蛋白400 μg于10%SDS-PAGE电泳、电转移到PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h，覆上SP1兔单抗(1∶1 000)过夜，TBST洗涤5次，每次5 min。加入荧光标记的山羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次15 min(注意避光操作)，扫描PVDF膜进行图像分析，实验重复3次。

3结果

3.1青蒿琥酯对NACC细胞增殖的抑制作用结果显示：青蒿琥酯作用24 h，对NACC细胞具有一定的抑制作用，各实验组及阳性对照组与空白组比较，结果均有统计学意义，实验组及阳性对照组间比较未见明显统计学差异(表1)。青蒿琥酯作用48 h，各实验组及阳性对照组与空白对照组比较，各实验组组间比较，除600 μmol·L-1ART组外其余各实验组同阳性对照组比较，结果均有统计学意义，F=169.098，P<0.001(表1)。

±s,n=3)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与阳性对照组比较，ΔΔΔP<0.001。

3.2青蒿琥酯对NACC细胞侵袭能力的抑制作用

400倍镜下每个副孔随机选取5个视野，计数穿膜细胞个数并求取平均值，空白对照组(103±15.4)个、37.5 μmol·L-1ART组(52±6.8)个、150 μmol·L-1ART组(22±2.9)个、600 μmol·L-1ART组(7.6±2.2)个、阳性对照组(5±1.6)个，结果显示，各实验组及阳性对照组穿膜细胞个数与空白对照组比较差异明显，具有统计学意义，37.5 μmol·L-1ART组穿膜细胞个数与600 μmol·L-1ART组及阳性对照组比较，差异有统计学意义，150 μmol·L-1ART组、600 μmol·L-1ART组及阳性对照组间比较，差异无统计学意义，F=139.939，P<0.001(图1A、1B)。空白对照组37.5 μmol·L-1ART150 μmol·L-1ART

600 μmol·L-1ART阳性对照组

图1A不同浓度ART干预NACC细胞 图1B不同浓度ART干预48 h对NACC细胞

48 h后(×400) 穿膜细胞数侵袭能力的抑制作用

注：**P<0.01，***P<0.001。

3.3青蒿琥酯对NACC细胞SP1蛋白表达的影响采用Western Blot法，进行蛋白含量检测。相对灰度值空白对照组(2.14±0.06)、37.5 μmol·L-1ART组(1.89±0.05)、150 μmol·L-1ART组(1.66±0.03)、600 μmol·L-1ART组(1.42±0.04)、阳性对照组(0.79±0.11)，结果显示:各实验组及阳性对照组于空白对照组相比，差异有统计学意义，各实验组及阳性对照组组间比较均有差异，具有统计学意义，F=200.998，P<0.001(图2A、2B)。

图2A　不同浓度ART干预NACC细胞

图2B　不同浓度ART干预NACC细胞48 h

注：***P<0.001。

4讨论

肿瘤的发生发展与体内各种因子间相互作用有着密切的关系，在众多因子之中，转录因子在细胞核内起着重要的作用，它们通过调控细胞周期相关分子、促癌及抑癌基因，影响着肿瘤的发生发展。SP1蛋白属于Sp/KLF转录因子家族，具有调控众多基因表达的能力，正常情况下，SP1蛋白在体内各种细胞中均有较稳定的表达，并对多种管家基因具有调控的功能[8-9]，会随着细胞的老化而逐渐减少表达。而在乳腺癌[10]、甲状腺癌等肿瘤组织中，SP1蛋白的表达水平显著高于正常组织的表达水平。有研究表明SP1蛋白的表达水平也影响着血管形成[11]，进而影响到肿瘤的生长和转移。而下调SP1的表达能够有效抑制肿瘤细胞的生长。因此SP1被公认为一个重要的促癌蛋白。

前期研究[5]中通过细胞划痕实验发现，青蒿琥酯通过抑制划痕愈合的方式表明其对腺样囊性癌NACC细胞运动能力的抑制作用，同时较低浓度的青蒿琥酯可以将NACC细胞阻滞在G1期，而当浓度达到50 mg·L-1时则可以将NACC细胞阻滞与G2期。本研究中，MTT实验结果表明使用青蒿琥酯干预NACC细胞，在作用24 h后，即表现出对NACC细胞增殖的有效抑制，伴随作用时间的延长，抑制NACC细胞增殖的效果也愈发明显，且呈现浓度依赖性，与前期研究结果相符，600 μmol·L-1的青蒿琥酯与5 μmol·L-1的顺铂作用效果比较接近；侵袭实验的结果表明，青蒿琥酯能有效抑制NACC细胞降解细胞周围基质并向周围组织浸润的能力，起到抑制肿瘤细胞侵袭的作用。

通过分析实验结果，我们发现青蒿琥酯作用于NACC细胞系后，成功的抑制了NACC细胞在体外的增殖和侵袭的能力，且具有浓度依赖性，这一结果同Western Blot检测SP1蛋白表达水平的结果保持较高的一致性，青蒿琥酯浓度越高，SP1蛋白表达水平下降的越明显，说明青蒿琥酯可以有效降低促癌蛋白SP1的表达；结合Schulze[12]对前列腺癌AKR1C3S基因启动子同SP1间关系的研究，以及Sankpal等[13]通过靶向抑制SP1的表达治疗前列腺癌的研究等众多研究结果，我们认为青蒿琥酯抑制腺样囊性癌增殖与侵袭的作用与NACC细胞SP1蛋白表达水平下降可能存在重要的联系。本实验为进一步探讨青蒿琥酯抑制肿瘤增殖侵袭作用的机制，将青蒿琥酯应用于腺样囊性癌治疗提供了体外实验的支持。

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CHEN Yu-lin1, CHEN Hu1, LI Jia-quan2, et al

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery，CollegeofStomatology;

2.MedicalScienceResearchCenter，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Abstract:Objective To explore the effect of artesunate (ART) on proliferation and invasion of novel human palatal salivary gland cell line of adenoid cystic carcinoma (NACC). MethodsThe changes of in vitro proliferation of NACC cells after being intervened for 24 and 48 hours by 37.5,150,600 μmol·L-1ART were analyzed by using MTT assay; the anti-invasion effect of ART at 37.5,150,600 μmol·L-1were tested by Transwell assay; the expression level of SP1 protein in each group was detected by Western Blot method. All experiments were performed with a control group and a positive control group with 5 μmol·L-1DDP.ResultsCompared with the control group, the effect of ART on the proliferation of NACC cells was significantly increased after treated for 24 hours (F=12.071,P<0.001), and the inhibition was more obvious than that by extending the intervention time to 48 hours (F=169.098,P<0.001). In Transwell assay, the number of cells passing through the membrane in experimental group (37.5,150,600 μmol·L-1ART groups) was significantly decreased, compared with the control group (F=139.939，P<0.001).Western Blot results showed that the expression levels of SP1 protein in 37.5,150,600 μmol·L-1ART and 5 μmol·L-1DDP positive control group were decreased (F=200.998,P<0.001), compared with the blank control group. ConclusionsArtesunate could effectively inhibit the NACC cell proliferation and invasive ability, and down-regulate the expression of transcription factor SP1.

Key words:artesunate;adenoid cysticcarcinoma;proliferation;invasion;transcription factor;SP1

收稿日期：(2015-10-12，修回日期：2015-11-23)

通信作者：农晓琳，女，教授，硕士生导师，研究方向：口腔颌面外科，E-mail：lab．nong@gmail.com

基金项目：国家自然科学基金项目(No 81360404)；广西省自然科学基金面上项目(No 2013GXNSFAA019231)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.006