漆黄素逆转慢性应激鼠认知损害及其机制

涂传龙，庄聪文，石晓磊，翁向群

(南京军区福州总医院侨宾科，福建 福州　350025)



漆黄素逆转慢性应激鼠认知损害及其机制

涂传龙，庄聪文，石晓磊，翁向群

(南京军区福州总医院侨宾科，福建 福州350025)

摘要：目的探讨漆黄素是否逆转慢性束缚应激小鼠认知损害及其机制。方法用CD1小鼠建立慢性束缚应激模型，漆黄素(25 mg·kg-1·d-1)灌胃给药14 d。Morris水迷宫检测空间学习记忆功能，Western blot检测相关蛋白表达变化。结果漆黄素明显改善应激鼠空间学习记忆功能，提高海马细胞外信号调节激酶ERK磷酸化水平，同时增加突触蛋白synapsin I、PSD95表达。ERK特异性阻断剂U0126完全阻断漆黄素改善认知。结论漆黄素改善慢性应激鼠认知功能，可能通过ERK通路调节神经可塑性有关。

关键词：漆黄素；慢性束缚应激；Morris水迷宫；海马组织

应激常激活下丘脑—垂体—肾上腺轴和提高应激激素，即糖皮质激素水平[1]。慢性应激常损害海马依赖的学习记忆功能[2]。海马与学习记忆功能密切相关，而其富含糖皮质激素受体，因此，海马组织特别易感于糖皮质激素升高，糖皮质激素长期升高，比如慢性应激，常损害海马组织结构，包括神经生化、兴奋性、神经元形态，甚至神经元死亡[3-4]。因此，慢性应激常损害海马依赖的学习记忆功能，比如Y-迷宫空间学习记忆[5]。漆黄素(3,3',4',7-四羟基黄酮)属于黄酮类化合物，富含于草莓等水果、蔬菜，口服可透过血脑屏障[6]。已有研究发现漆黄素能够抑制氧化应激导致的神经细胞死亡[7]，具有神经营养因子的活性[8]，易化海马脑片长时程增强(long-term potentiation,LTP)[9]，改善阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, AD)认知功能[10]。因此，既往这些研究表明漆黄素具有改善脑学习记忆功能。

漆黄素是否改善慢性应激导致的认知损害尚未见报道，我们前期的实验发现慢性束缚应激导致认知损害，包括海马依赖的依赖的空间学习记忆功能。为证实漆黄素是否改善慢性应激导致的认知损害，慢性应激鼠给予漆黄素，并观察漆黄素是否改善认知功能，同时探讨具体的细胞分子机制。

1材料与方法

1.1动物雄性CD1(ICR)小鼠8～10周龄，CD1小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2002-0003。动物饲养于环境温度24～27℃，自由获得食物和水，光照周期12 h。动物适应1周后才开始实验处理。

1.2药品及试剂漆黄素粉末购买于美国Sigma公司，纯度≥98%，漆黄素溶解于5%羧甲基纤维素钠溶液，连续漆黄素灌胃(25 mg·kg-1) 14 d,对照组给予等体积5%羧甲基纤维素钠溶液。U0126，ERK特异性阻断剂，溶于50%二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，最终浓度为1 mg·L-1，漆黄素给药前30 min双侧背侧海马微量注射U0126，每侧注射量为0.5 μL，每天注射1次，连续给药14 d。ERK抗体(cell signaling technology公司)、Phospho-ERK抗体(cell signaling technology公司)、Synapsin I抗体(Abcam公司)、PSD95抗体(Abcam公司)。

1.3慢性束缚应激CD1鼠塞于50 mL通风离心管，保持小鼠仅能呼吸运动，每天3 h，连续21 d，束缚应激结束后放回饲养笼。束缚应激期间对照鼠禁饮禁食3 h。

1.4Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验据以往报道[11]，略作修改。迷宫置于空间信息丰富的实验周围环境，作为动物学习过程中的空间参照物，且整个实验期间周围环境信息固定不变。水迷宫均分为4个象限，将平台置于其中一象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径，保持平台位置固定不变。选择剩下的3个象限作为动物的入水点，动物面向池壁放入水中，每天训练4次，分别从4个象限入水，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。训练时间为60 s，动物放入水中，若动物在60 s内找到平台，则寻平台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留15 s，以便动物观察周围环境。若动物在60 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为60 s，并引导动物登陆平台并使其在平台上停留15 s。每天每只动物4次训练的潜伏期、游泳路程、游泳速度的平均值，作为评价动物学习能力的指标。经过5 d的训练学习，第6天撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测60 s内在原平台象限的时间比，作为评价空间记忆能力的重要指标。

1.5突触小体的准备与Western blot适量海马组织加入匀浆液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES (pH 7.4)，1×蛋白酶抑制剂混合物)中匀浆，匀浆液1 000×g、4℃离心10 min，上层液12 000×g、4℃离心15 min，细胞碎片重新加入匀浆液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES (pH7.4)，1×蛋白酶抑制剂混合物)中匀浆，匀浆液12 000×g、4℃离心15min，突触小体碎片加入溶液(50 mmol·L-1HEPES (pH7.4)，2 mmol·L-1EDTA，1×蛋白酶抑制剂混合物)，即为突触小体蛋白提取物，检测突触膜蛋白表达变化。BCA法制作标准曲线，测定样品总蛋白浓度。SDS-PAGE胶单孔上样量20 μg总蛋白，恒压(80～120 V)电泳，恒流250 mA电转膜后封闭PVDF膜1 h，一抗4℃冰箱摇床孵育过夜，二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗脱3次后化学发光成像系统发光。

1.6脑立体定位及双侧套管安置取实验用小鼠，称重，用2%戊巴比妥钠麻醉，剂量为40 mg·kg-1。待小鼠完全麻醉后，将其固定在立体定位仪上，使其头部固定并尽量保持水平。将针管对准前囟，以前囟为基点，按照需要定位的脑区坐标，在颅骨表面找到相应位置，做上记号。用钻头在记号处钻孔，将针管按照定位坐标的深度插入到需要的脑区。用牙托粉固定套管。双侧背侧海马具体坐标如下：(前囟为基点)前囟向后1.8 mm，中线旁开1.4 mm，向下2.2 mm。套管安放好之后，小鼠需休息1周再展后续的实验。

1.7数据统计与分析运用SPSS 20.0统计软件进行资料分析。试验观测资料主要为计量数据，表示为多组间的比较，为单因素方差分析+LSD多重比较；重复测量的资料则行重复测量方差分析，其组间两两比较为成组t检验，时点间两两比较为差值t检验，并采用Bonferroni法进行显著性水准的调整。

2结果

2.1漆黄素逆转慢性束缚应激导致的认知减退Morris水迷宫实验定向航行试验及探索试验结果见图1。以单因素重复测量方差分析寻找平台潜伏期资料，提示对照组、漆黄素+应激组训练天数均有统计学意义(P<0.05)，而应激组训练天数无统计学意义(P>0.05)。第1天各组小鼠寻找平台潜伏期无显著差异(P>0.05)，第2～5天定向航行学习，漆黄素可使应激鼠寻找平台潜伏期明显缩短(P<0.01)。探索试验中，与对照组相比，应激组在目标象限时间百分比明显减少(P<0.05)，而漆黄素延长应激鼠目标象限时间百分(P<0.05)。各组小鼠寻找平台潜伏期差异可能由于小鼠游泳能力差异造成，统计学发现第1～5天各组小鼠平均游泳速度无显著差异(P>0.05)，说明各组小鼠自发活动能力均正常，提示漆黄素逆转慢性应激鼠空间认知损害。

图1　漆黄素改善慢性束缚应激鼠

注：A.Morris水迷宫定向航行试验逃离潜伏期；B.空间探索试验平台象限游泳时间百分比；与对照组对比，*P<0.05；与应激组相比，#P<0.05；C.代表性航行试验轨迹图(从左至右依次为对照组、应激组、应激+漆黄素组)。

2.2漆黄素提高慢性束缚应激鼠海马突触蛋白表达经单因素方差分析+两两比较：与对照组相比，应激组海马突触前蛋白Synapsin I和突触后蛋白PSD95均表达减少(P<0.05)，慢性漆黄素处理逆转两种蛋白的减少(P<0.05)。突触膜蛋白的表达变化，常提示突触形态和数量改变,即神经可塑性的改变。见图2。

图2　漆黄素增加慢性束缚应激

注：A.western blot检测海马膜蛋白表达变化；B.相对蛋白条带强度；与对照组对比，*P<0.05；与应激组相比，#P<0.05。

2.3抑制海马ERK活性阻断漆黄素改善认知功能经比较：与对照组相比，应激组海马磷酸化ERK表达减少(P<0.05)。应激组与漆黄素+应激组海马磷酸化ERK表达具有显著差异(P<0.01)，因此,漆黄素逆转应激导致的磷酸化ERK水平降低。各组总ERK表达差异无统计学意义(P>0.05)。考虑到漆黄素给药后磷酸化ERK水平增高，可能漆黄素激活ERK通路发挥作用，为证实这一发现，漆黄素灌注口服前半小时海马局部脑区微量注射ERK阻断剂U0126，观察两者之间的关系。见图3。Morris水迷宫检测应激鼠空间学习记忆能力，第1天各组小鼠寻找平台潜伏期无显著差异(P>0.05)，第2～5天定向航行学习，漆黄素可使应激鼠寻找平台潜伏期明显缩短(P<0.01)，漆黄素+U0126组差异无统计学意义(P>0.05)。探索试验中，双向方差分析示漆黄素处理存在主效应(P<0.05)，漆黄素与U0126处理存在交互作用(P<0.05)，而U0126处理主效应无显著差异(P>0.05)。统计学发现第1～5天各组小鼠平均游泳速度无显著差异(P>0.05)，说明漆黄素、U0126均不影响小鼠自发活动。见图4。

图3　漆黄素提高慢性束缚应激

注：A.western blot检测海马磷酸化蛋白水平变化；B.相对蛋白条带强度；与对照组对比，*P<0.05；与应激组相比，#P<0.05。

3讨论

慢性应激常伴长期糖皮质激素增高，富含糖皮质激素受体的海马结构易感于应激，而海马是学习记忆的重要部位，因此，慢性应激可损害海马依赖的学习记忆功能。慢性应激损害海马的可能机制包括CA3区神经细胞重塑、突触活性的抑制和海马体积的缩小[12]。应激是不可避免的，并且会导致认知损害，本实验发现慢性束缚应激损害海马依赖的水迷宫空间学习与记忆能力，而慢性口服漆黄素可逆转其改变。过量糖皮质激素或行为应激导致海马锥体神经元树突棘萎缩和退化，导致神经纤维网的稀疏[13]。长期过量糖皮质激素也可能导致海马锥体神经元死亡[14]。慢性束缚应激导致海马突触膜蛋白表达减少，而漆黄素增加其表达。而突触膜蛋白的表达增加常意味着突触数量和密度的增加。既往研究发现漆黄素可激活神经细胞内的ERK通路[7]，且通过激活ERK发挥神经保护、神经营养因子活性和认知增强效应[9]，最近研究发现激活ERK通路是漆黄素发挥保护亨廷顿病模型PC12细胞所必需[15]，且是漆黄素改善阿尔茨海默病行为改变和减轻神经病理所必需[10]。本实验发现慢性给予漆黄素后应激鼠海马ERK磷酸化水平增高，为证实海马ERK通路参与漆黄素改善应激导致的认知损害，海马微注射ERK抑制剂U0126完全阻断漆黄素改善认知，从而证实ERK通路参与漆黄素改善认知。总之，本实验证实慢性束缚应激损伤海马空间认知，而漆黄素改善慢性应激导致的认知损害，通过增加海马突触膜蛋白表达，且通过ERK通路改变神经可塑性来发挥改善认知功能。

图4　ERK阻断剂完全拮抗漆黄素改善慢性

注：A.Morris水迷宫定向航行试验逃离潜伏期；B.空间探索试验平台象限游泳时间比；与应激组对比，*P<0.05。

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◇药学研究◇

Fisetin reverses cognitive impairment provoked by chronic stress

and mechanism in mice

TU Chuan-long, ZHUANG Cong-wen, SHI Xiao-lei,et al

(FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:Objective To investigate whether fisetin treatment prevents cognitive deficits provoked by chronic stress and mechanism in mice.MethodsMice were subjected to chronic restraint stress for 21 days. Stressed mice received repeated gavage of 25 mg·kg-1fisetin once daily for 14 consecutive days. Morris water maze (MWM) task was conducted for evaluating hippocampus-associated learning and memory. The expression levels of proteins in the hippocampus of mice were analyzed by western blot. ResultsFisetin dramatically ameliorated the cognitive impairments in the stressed mice, rescued the decrease of hippocampal phospho-ERK level. Moreover, fisetin significantly improved synapse-associated proteins synapsin I and PSD95 expression. The ERK inhibitor, U0126, antagonize the fisetin-induced enhancement of cognitive function.ConclusionsFisetin improves cognitive deficits provoked by chronic stress in mice, which may attribute to ERK signaling pathway involved in the hippocampus.

Key words:fisetin;chronic restraint stress;Morris water maze;hippocampus

收稿日期：(2015-08-17，修回日期：2015-11-09)

通信作者：翁向群，女，副主任医师，研究方向：老年病，E-mail：xqwengzj@163.com

基金项目：福建省自然科学基金面上项目(No 2009J01188)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.004