新疆酸石榴皮提取物的体外抑菌实验研究

田玉娥， 刘江杰， 王东东, 田　莉

(1武警兵团指挥部医院，乌鲁木齐　830063； 2新疆医科大学中医学院； 3新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐　830011)



新疆酸石榴皮提取物的体外抑菌实验研究

田玉娥1， 刘江杰1， 王东东2,3, 田莉2,3

(1武警兵团指挥部医院，乌鲁木齐830063；2新疆医科大学中医学院；3新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐830011)

摘要：目的研究石榴皮不同极性提取物的体外抑菌活性，寻找抗菌活性成分。方法采用微孔板法和稀释法研究石榴皮不同极性提取物对变异链球菌和大肠杆菌生长及其生物膜形成的影响。结果石榴皮的不同极性提取物对变异链球菌和大肠杆菌的生长无明显抑制作用，而对其生物膜形成有明显抑制作用，石榴皮正丁醇、乙醇和水提取物对变异链球菌生物膜形成有明显抑制作用，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物对大肠杆菌生物膜的形成有不同程度的抑制作用。结论石榴皮提取物对变异链球菌生长和大肠杆菌生物膜形成具有较好的抑制作用，值得进一步研究开发。

关键词:石榴皮；提取物；体外抗菌活性；生物膜；稀释法

石榴皮为石榴科(Punicaceceae)植物石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮。该药材收载于《中国药典》和《维吾尔药志》，具收具有涩肠、止血、杀虫功效，用于治疗各类痢疾、小儿消化不良、烧伤、炎症等疗效显著[1-2]。现代研究发现，石榴皮具有抗菌、抗病毒、抗癌、降糖、免疫调节、改善心血管系统等作用[3]。新疆石榴品种好，栽培面积广，资源丰富，利用石榴自然脱落的花瓣进行药学研究，极具实用价值。本研究采用微孔板法和稀释法进行石榴皮不同极性部位提取物体外抗菌实验的初步研究，为石榴皮有效成分的成药性研究提供实验依据。

1仪器与材料

SPECTRAMAX 190酶标仪(美国Molecu1ar Devices公司)，YJ-875A医用净化工作台(苏州金燕净化设备厂)，DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)， 3110系列CO2培养箱(Thermo Scientific Water Jacketed Incubator，USA)，YXQ-LS-SI全自动立式电热压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业医疗设备厂)，XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。石榴皮(Flos granati)购于新疆维吾尔自治区维吾尔医院，经新疆医科大学中医学院乌莉娅·沙衣提教授鉴定为石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮。变异链球菌(ATCC 700610)、大肠杆菌(ATCC 35218)均购自中国药品生物制品检定所，BHI培养基(Brain Heart Infusion Broth，Dickinson and company，USA)，NB培养基(Nutrient Broth，Dickinson and company，USA)，结晶紫(上海研晶生物科技有限公司，CAS548-62-9)，去氧胆酸钠(Sodium deoxycholate，SD ，Sigma-Aldrich公司)，所用试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1石榴皮提取物的制备精密称取石榴皮粗粉200 g，用石油醚1.5 L回流提取1.5 h后，滤过，滤渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水1.5 L回流提取2 h后滤过，均重复提取3次，滤液分别置于旋转蒸发仪中浓缩减压后得稠浸膏，再经冷冻干燥成粉末，均密封冷藏备用。

2.2石榴皮提取物化学成分鉴别分别取石榴皮不同极性提取物适量，加入蒸馏水溶解，采用试管法进行化学成分的理化鉴别。结果石榴皮不同极性提取物中含有糖、苷类、酚类鞣质、黄酮类、有机酸、氨基酸和蛋白质等成分，见表1。

2.3抑菌实验

2.3.1菌种复苏与培养将变异链球菌(ATCC 25923)、大肠杆菌(ATCC 25922)标准菌种置于装有2 mL培养基的有盖试管中，置于37℃、5% CO2培养箱内培养16 h后，经比浊法判断试管变浑浊，表明菌种已复苏。把灭菌培养皿和培养基倒平板，冷却凝固后，用接种针挑取少许复苏后的标准菌种划线接种，37℃恒温培养箱中培养24 h后进行活化，使菌种有较强的活力。经复苏转种培养后，取新传代大肠杆菌、变异链球菌置于已灭菌的装有2 mL培养基的有盖试管中，加入适量40%葡萄糖，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，培养液用肉汤培养基稀释，充分震荡后并用麦氏比浊管法调整菌液浓度为109CFU/mL。

表1　石榴皮化学成分鉴别

2.3.2微孔板法筛选抑菌活性采用96孔微孔板进行抑菌活性的快速筛选[4]。分别取变异链球菌、大肠杆菌悬液用培养液50倍稀释，混匀。把石榴皮不同极性提取物分别溶解在适宜溶剂中制成2 000 μg/mL的溶液，经微孔滤膜除菌后，在96孔板上用肉汤培养基与大肠杆菌、变异链球菌作连续对倍稀释，使含药浓度分别为1 000、500、250、125、62.5 μg/mL。相同条件下，以纯二甲亚砜作为溶剂对照，仅含菌液作为空白对照，以阿莫西林作为阳性对照，同一板重复3次，共置于37℃、5% CO2培养箱内培养18 h，以培养液透明为无菌生长的最低抑菌浓度(MIC值)。

2.3.3抑菌效果的测定用酶标仪于450 nm波长处测定细菌的OD(Optical Density)值，将96孔板用蒸馏水清洗数遍，再用1%结晶紫染色15 min，用蒸馏水冲洗至透明后，加入2%的SD洗脱生物膜，再用酶标仪于605 nm波长处测试生物膜的OD值。

抑菌率的计算方法：抑菌率(%)=(溶剂OD值-样品OD值)/溶剂OD值。

2.3.4石榴皮不同极性提取物对变异链球菌的抑菌率石榴皮不同极性提取部位对变异链球菌的生长无明显抑制作用；正丁醇、乙醇和水提取物对变异链球菌生物膜形成有明显抑制作用，正丁醇、乙醇提取物浓度为250 μg/mL时，抑制率>50%，见表1、2。

表1石榴皮不同极性提取部位抑制变异链球菌生长的抑制率/%

稀释度浓度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-122.21-17.97-15.97-35.70-117.791∶4500-25.19-7.52-9.30-14.79-50.581∶8250-13.418.6941.49-4.41-33.111∶16125-5.384.9138.87-6.93-10.121∶3262.5-4.331.7220.290.46-2.43

表2石榴皮不同极性提取部位抑制变异链球菌生物膜形成的抑制率/%

稀释度浓度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-119.0138.7564.5553.3448.021∶4500-27.4431.7652.5854.5941.731∶825021.468.4251.0749.5741.041∶1612515.44-76.6246.3119.186.171∶3262.52.44-85.6514.65-44.02-72.60

2.3.5石榴皮不同极性提取物对大肠杆菌的抑菌率石榴皮不同极性提取部位对大肠杆菌的生长无抑制作用；氯仿、乙酸乙酯提取物对大肠杆菌生物膜的形成有不同程度的抑制作用，其中氯仿提取物浓度为250~500 μg/mL时，抑制率>50%，见表3、4。

2.3.6石榴皮不同极性提取物对受试菌的MIC依据MIC的判断标准，确定石榴皮正丁醇提取物抑制变异链球菌生长的MIC为125 μg/mL，乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水提取物抑制变异链球菌生物膜形成的MIC分别为500、125μ、250、250 μg/mL。石榴皮氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物抑制大肠杆菌生物膜形成的MIC分别为250、500、125 μg/mL。

表3石榴皮不同极性提取部位抑制大肠杆菌生长的抑制率/%

稀释度浓度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-70.21-82.91-220.91-269.15-196.371∶4500-79.71-162.52-163.24-281.54-202.251∶8250-76.12-102.41-53.52-161.43-229.631∶16125-35.53-79.24-60.97-95.71-107.441∶3262.5-60.01-57.55-63.15-72.58-62.96

表4石榴皮不同极性提取部位抑制大肠杆菌生物膜形成的抑制率/%

稀释度浓度/(μg/mL)氯仿乙酸乙酯正丁醇乙醇水1∶21000-2.9746.05-39.21-44.37-33.361∶450074.8336.87-26.89-42.64-25.811∶825069.7028.5134.44-7.0315.481∶161253.5910.1129.1217.5716.731∶3262.55.3719.8117.7830.5115.19

3讨论

细菌生物膜(Biofilm)是细菌被包裹在自身分泌的多聚物中形成具高度分化结构的特殊细胞群体结构，是细菌的一种保护性生长模式，80%的细菌性感染与其有关[5]，主要有由革兰阳性球菌导致的龋齿、革兰阴性厌氧性口腔细菌导致的牙菌斑、肠道细菌引起的胆囊感染及大肠杆菌和其他革兰阴性菌引起细菌性前列腺炎等[6]。本研究依据石榴皮对口腔和消化道的抗菌消炎功效选取口腔主要的致龋菌变异链球菌和肠道细菌大肠杆菌，考察石榴皮不同极性部位对供试菌的抑菌作用，为其成药性研究提供药效依据。

本研究经化学鉴别预试验检出石榴皮中含糖、苷类、酚类鞣质、黄酮类、有机酸、氨基酸和蛋白质等成分。石榴皮不同极性提取物进行抑菌筛选时，发现有些提取物有促进细菌生长的趋势，可能其所含糖类、蛋白质、氨基酸等成分为细菌生长提供了营养成分。石榴皮的不同极性提取物对变异链球菌和大肠杆菌的生长均无明显抑制作用，而对二者生物膜的形成均有不同程度的抑制作用，石榴皮正丁醇、乙醇和水提取物对变异链球菌生物膜形成有明显抑制作用，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物对大肠杆菌生物膜的形成有明显的抑制作用。石榴皮中含有能有效抑制供试菌生物膜形成的活性成分，石榴皮的酚类和黄酮类成分具有明显的抗菌活性[7]。陈雪珊等[8]研究表明，以石榴皮的提取液、浓缩液、 冻干粉

和软膏对变异链球菌和大肠杆菌乙醇有明显的抑菌作用，但未确定有效成分类别。因此，对其抑菌成分、机理以及对其他细菌的影响还有待于更进一步的研究。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中国药典(2010年版)[S].一部.北京:中国医药科技出版社, 2010: 87.

[2]刘勇民.维吾尔药志[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1999: 100.

[3]热依木古丽·阿布都拉,来海中,马依努尔·拜克力,等.石榴皮化学成分及生物活性研究进展[J].新疆医科大学学报,2013,36(6):737-740.

[4]田莉,畅静,田树革.维药材欧绵马提取物的体外抑菌实验研究[J].新疆医科大学学报,2014,37(9):1108-1110.

[5]屈常林,高洪,赵宝洪,等.细菌生物被膜与抗生素耐药机制研究进展[J].动物医学进展, 2008, 12(3): 86-90.

[6]Stewat PS, Costerton JW. Antiblotic resistance of bacteria in biofilms[J].Lancet,2001，358(9276):135-138.

[7]史李娜,王雪飞,马桂芝,等.石榴皮鞣质的抗菌效果及毒性研究[J].中国药理学通报, 2015,31(5): 709-715.

[8]陈雪珊,高晓黎.石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及石榴皮软膏的体外抑菌试验[J]. 新疆医科大学学报, 2009,32(5)：565-567.

(本文编辑施洋)

Study on the antibacterial test of pomegranate peel extracts in vitro

TIAN Yue1，LIU Jiangjie1， WANG Dongdong2,3, TIAN Li2,3

(1HospitaloftheArmedPoliceCorpsHedquarter,Urumqi830063,China；2CollegeofTCM,

XinjiangMedicalUniversity；3XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescriptionand

ScienceofFormula,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activities of the different solvent extracts from pomegranate peel and find antibacterial active components. MethodsMicrowell plate method and double dilution method were used to determine the influence of growth and biofilm formation about the different solvent extracts of pomegranate peel against streptococcus mutans and Escherichia col. ResultsThe extracts with different solvnts of pomegranate peel have no inhibition on the growth of stretopcoccus mutans and Escherichia col, ,but have obvious inhibitory effect on biofilm formation. .N-butanol extract, ethanol extract and water extract of pomegranate peel showed the obvious antibacterial activity on the biofilm formation of stretopcoccus mutans. Chloroform extract, ethyl acetate extract and n-butanol extract showed the different levels of antibacterial activity on the biofilm formation of Escherichia col. ConclusionThe extracts of pomegranate peel have obvious antibacterial activity on the growth of streptococcus mutans and biofilm formation of Escherichia col. which is worth researching and developing..

Keywords:pomegranate peel；extracts；antibacterial test in vitro；biofilm；dilution method

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.004

中图分类号：R963

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)02-0142-04

作者简介：田玉娥(1973-),女，本科，主治医师，研究方向：中西医结合皮肤病研究。通信作者：田莉，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药民族药新制剂研究与开发，E-mail：tianli109@126.com。

基金项目：国家自然科学基金(81260668)；新疆医科大学“ 天山英才工程” 专项基金(Y0382002)