基于Caco-2细胞单层模型研究鞣花酸的转运特性

田　莉， 谢　莉， 张慧慧， 高晓黎

(1新疆医科大学中医学院; 2新疆名医名方与特色方剂学重点实验室; 3新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　830011)



基于Caco-2细胞单层模型研究鞣花酸的转运特性

田莉1,2， 谢莉1， 张慧慧1， 高晓黎3

(1新疆医科大学中医学院;2新疆名医名方与特色方剂学重点实验室;3新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011)

摘要：目的研究鞣花酸在Caco-2细胞单层模型上的转运特性。方法利用MTT法确定鞣花酸单体在Caco-2细胞单层模型转运过程的安全浓度区间。以鞣花酸的表观渗透系数(Papp)和累积转运量为衡量指标，采用高效液相色谱法(HPLC)测定鞣花酸含量，考察不同浓度、不同孵育时间的鞣花酸在Caco-2细胞单层模型上的双向转运过程。结果鞣花酸的累计转运量与孵育时间、给药浓度呈正相关，不同浓度的鞣花酸Papp值差异明显且吸收作用明显强于外排作用，外排比均<1.5。结论鞣花酸单体在Caco-2细胞模型的双向转运过程中以主动转运为主，外排蛋白可能未参与转运过程，鞣花酸为难吸收的一类药物。

关键词：Caco-2细胞单层模型； 鞣花酸； HPLC； 转运

鞣花酸属于没食子酸的二聚体衍生物，是石榴皮中多酚类物质的主要成分之一，约占石榴皮多酚精制物的20.4%[1]。研究表明，鞣花酸具有抗癌变、抗菌、抗病毒、抗氧化等多种生理和药理活性作用，在食品、化妆品、医疗等领域被广泛应用[2-3]。

目前有关鞣花酸的吸收机制未见报道。Caco-2细胞模型已广泛用于预测药物小肠吸收和转运机制的研究[4]。本研究采用Caco-2细胞模型考察鞣花酸的转运特性，以期为石榴皮多酚和鞣花酸口服剂型设计和临床应用提供药动学依据。

1仪器与材料

1.1细胞株Caco-2细胞株购自于武汉博士德生物工程有限公司(批号：CX0064)。

1.2药品及试剂Angilent高效液相色谱仪LC-6AD 、CBM-20A色谱工作站、SPD-20A 型紫外检测器、SIL-20A 型自动进样器、DKZ系列恒温振荡浴槽(上海恒科学仪器有限公司)，CO-150 型二氧化碳孵箱 (美国NBS公司)，XS105型电子天平(德国，梅特勒-托利多)，TDL-40B高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，BA210型光学显微镜(Motic公司)，SPECTRAMAX 190酶标仪(美国，Molecu1ar Devices公司)，BCA蛋白分析试剂盒(Pierce，美国)，12孔Transwell 细胞转运培养小室(美国Corning公司，0.4 μm Pore Size，批号：13413031)。鞣花酸对照品(成都曼思特生物科技有限公司；生产批号：R-004-140731)，DMEM培养基(高糖型，美国Hyclone公司，批号: 1439934)，胎牛血清( 美国Gibico公司，Lot:1439934)，非必需氨基酸(美国Hyclone公司，批号:AYM175938)，L-谷氨酰胺(美国Hyclone公司，批号:08H07A12)，青霉素-链霉素双抗液(美国Hyclone 公司，批号: J130031)，胰蛋白酶(含 0.02% EDTA ，美国Hyclone公司，批号: J140003)，HBSS平衡盐溶液(美国Hyclone公司，批号: 03C06A75)，PBS磷酸盐缓冲液(美国HyClone公司，批号:NAF14010)，二甲基亚砜(DMSO，华美生物公司)，二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT，美国Amresco公司)，甲醇(Fisher Scientific；色谱纯)，屈臣氏蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

2方法与结果

2.1溶液的配制精密称取鞣花酸5.4 mg，置于5 mL 容量瓶中，加入DMSO溶解，定容，即得1.080 mg/mL鞣花酸储备液，冷藏，备用。

2.2色谱条件YMC-Triart C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶0.4%磷酸(55∶45)，柱温35℃；检测波长254 nm，流速1 mL/min，进样量20 μL。

2.3样品处理转运试验结束后，样品迅速12 000 r/min离心10 min，取上清液置-20℃保存。

2.4专属性按“2.2”项下的色谱条件，分别对空白HBSS转运液、空白转运液+鞣花酸对照品、鞣花酸转运样品进行HPLC分析，鞣花酸对照品的保留时间与转运样品的保留时间一致，空白转运液无干扰，见图1。

A：空白HBSS转运液

B：鞣花酸对照品

C：鞣花酸转运样品

图1鞣花酸的HPLC色谱图

2.5线性关系考察将“2.1”项下方法制备的鞣花酸储备液用HBSS溶液稀释成25 μg/mL的工作液，过滤，分别吸取0.5、1、2、4、6、8、10、20 μL进样测定，以鞣花酸峰面积(A)对进样量(X)进行线性回归，得回归方程为A=1 987 496.98X+5 034.48 (r=0.999 8)，表明鞣花酸进样量在0.025 4~1.016 0 μg范围内线性关系良好。

2.6精密度试验按“2.1”项下方法制备的鞣花酸储备液，用空白转运液分别制备低(6.13 μg/mL)、中(12.25 μg/mL)、高(25 μg/mL)3个浓度的样品，按“2.2”项下色谱条件测定，重复进样6次，结果低、中、高浓度测定的峰面积的RSD值分别为3.02%、2.05%、1.87%，表明该方法精密度良好。

2.7稳定性试验分别取低(6.13 μg/mL)、中(12.25 μg/mL)、高(25 μg/mL)3个浓度的鞣花酸样品，考察样品于37℃下放置3 h的稳定性、样品于室温下放置4 h的稳定性及样品于-20℃下放置的稳定性。结果表明样品于37℃下放置3 h可保持稳定，样品于室温下放置4 h内保持稳定，于-20℃条件下放置2 w保持稳定。

2.8加样回收率试验分别取低(6.13 μg/mL)、中(12.25 μg/mL)、高(25 μg/mL)3个浓度的鞣花酸样品作为本底值，将 50.00 μg/mL的鞣花酸对照品溶液作为加入量。按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果显示，鞣花酸低、中、高浓度的加样回收率分别为88.97%、95.68%、101.45%，表明该方法具有较好的准确度。

2.9Caco-2单层模型的建立与评价[5]以DMEM高糖培养基为培养液(其中含10%FBS、1%非必需氨基酸、1%双抗)，置于培养瓶中，隔天换液，待细胞长至80%时以1∶3进行传代，传2代后，将细胞以2×105个/孔接种于12孔Transwell 小室中，第1 周隔天换液，1 w后每天换液，连续培养至21 d。在倒置显微镜下观察细胞形态可见细胞连接紧密(图2)，测定细胞电阻值的变化，结果发现14 d后电阻> 600 Ω/cm2，且越往后电阻值增长越慢，表明Caco-2细胞单层模型建成，细胞有较好的紧密性和完整性，可进行转运试验，见图3。

图2　Caco-2细胞培养至21 d的细胞形态图

图3　细胞跨膜电阻值随时间变化图(n=3， ±s)

2.10MTT法确定鞣花酸的安全浓度范围将细胞以4×104个/mL孔接种于96孔培养板，置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱孵育24 h，用HBSS溶液清洗细胞2次后，分别加入HBSS溶液稀释后的鞣花酸不同浓度工作液(50、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL)为实验组，加入HBSS溶液的为空白组，继续培养4 h后，分别加入5 mg/mL的MTT试剂20 μL，继续培养4 h，弃去孔内的MTT试剂，分别另加150 μL DMSO，37℃恒温振荡10 min，充分溶解蓝紫色结晶。在酶标仪中490 nm处测定吸光度(A)，计算细胞存活率：细胞存活率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)。结果表明，不同浓度鞣花酸组间无显著差异，各浓度梯度对Caco-2细胞的抑制不明显，细胞存活率均>80%，可确定在1.25~50μg/mL浓度范围内为安全浓度，可进行Caco-2细胞双向转运试验。

C/(μg/mL)Papp/(cm/s)AP-BLBL-APERB-A/A-B103.57±0.031.54±0.140.43206.59±0.032.74±0.140.42408.68±0.244.27±0.080.49

3讨论

Caco-2细胞来源于人类的结肠腺癌细胞，具有与人体小肠上皮细胞相类似的结构和功能，生长到一定程度时可分化出微绒毛且连接紧密，不仅能分泌出类似于小肠刷状缘上皮相关的酶系，而且在一定程度上可表达相关的蛋白，能在细胞水平上提供有关药物吸收转运的的信息[4,7]。Caco-2细胞培养过程操作要求较高，但仍不失为一种药物吸收研究的快速、可靠的筛选工具，并已被美国FDA批准为药物吸收筛选模型用于药物体外吸收机制及药物相互作用等方面的研究[7]。

本实验利用 Caco-2细胞单层细胞模型研究鞣花酸的双向转运特性，以细胞毒性试验MTT比色法对Caco-2细胞进行存活和生长检测，受损伤的活细胞线粒体中存在琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成蓝紫色结晶甲瓚(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，该法操作简便、重复性好。鞣花酸MTT试验表明，Caco-2细胞在给药培养4 h后，鞣花酸低浓度对细胞具有轻微促进作用，高浓度具有轻微抑制作用，但浓度在1.25~50μg/mL范围内，细胞的存活率均> 80%，说明此浓度范围为细胞给药的安全浓度。在双向转运过程中，鞣花酸的累积摄取量随转运时间和转运浓度的增加而增加，表观渗透系数Papp(AP-BL)明显高于Papp(BL-AP)，且外排比均<1.5，说明鞣花酸的吸收主要以主动转运为主，转运过程中需要载体和消耗能量，外排蛋白可能对整个转运过程影响不大。

参考文献：

[1]丁楠,高晓黎.HPLC法测定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J].新疆医科大学学报,2012,35(6): 770-772.

[2]冯立娟,陶吉寒,尹燕雷,等.石榴功能物质鞣花酸研究进展[J].食品科学,2014,35(23): 325-330.

[3]热依木古丽·阿布都拉,来海中,马依努尔·拜克力,等.石榴皮化学成分及生物活性研究进展[J].新疆医科大学学报,2013,36(6):737-740.

[4]余自成,高瑜,田薇薇,等.肠道转运Caco-2细胞单层模型的建立及验证评价[J].中国临床药学杂志，2012,21(4):218 -221.

[5]胡律江,郭慧玲,胡志方,等. LC-MS考察α-香附酮在Caco-2细胞模型中转运特性[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(5):35-38.

[6]郑琴,周欢,熊文海,等.乌头碱在Caco-2细胞模型上的转运行为[J].中国实验方剂学杂志, 2014,20(20): 121-124.

[7]祝倩,郭宇星,潘道东,等. Caco-2细胞模型构建及抗高血压肽VPP和IPP小肠吸收机制研究[J].食品科学,2014,35(15):226-231.

(本文编辑施洋)

Transport characteristics of ellagic acid across Caco-2 cell monolayer model

TIAN Li1,2，XIE Li1，ZHANG Huihui1, GAO Xiaoli3

(1CollegeofTCM,XinjiangMedicalUniversity;2XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescription

andScienceofFormula；3CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo study the transport behavior of ellagic acid in Caco-2 cell monolayer model. MethodsMTT method was employed to confirm safe concentration range of ellagic acid monomer of transport processes in Caco-2 cell monolayer model. The samples concentrations of ellagic acid were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).The apperent partion coefficient value(Papp)and the transport total amount were caculated. Bidirection transport behavior of ellagic acid by incubating in different concentration and time were study. ResultsThe transport cumulative amount of ellagic acid with incubation time, the administration concentration was positively correlated, the Pappvalues of different concentration ellagic acid have differences and the absorption effect was stronger than platoon role. The efflux ratio (ER) values <1.5. ConclusionThe active transport of the ellagic acid monomer in the Caco-2 cell model was based on the active transport, Efflux proteins may not be involved in the transport process, ellagic acid belong to the hard absorption drugs.

Keywords:Caco-2 monolayer model; ellagic acid; HPLC; transport

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.002

中图分类号：R963

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)02-0135-04

作者简介：田莉(1974-)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药民族药新制剂研究与开发， E-mail： tianli109@126.corn。

基金项目：国家自然科学基金(81260668)；新疆医科大学“ 天山英才工程” 专项基金(Y0382002)