油茶籽及其饼粕对黄曲霉的拮抗作用

张飞飞， 王亚萍， 姚小华， 仲山民， 费学谦

(1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江富阳 311400；2.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 311300)



油茶籽及其饼粕对黄曲霉的拮抗作用

张飞飞1,2， 王亚萍1*， 姚小华1， 仲山民2， 费学谦1

(1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江富阳 311400；2.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 311300)

油茶是我国南方地区主要的木本油料作物[1]，油茶籽可以提取得到油茶籽油，因其具有重要的保健功能而深受消费者喜爱[2]。但是油茶籽在储存、运输和加工过程中却存在着被有毒有害物质污染的风险[3]，在这一过程中黄曲霉毒素因其致癌性强、性质稳定而备受关注。黄曲霉毒素多存在于霉变的粮油制品中[4]，为晶体物质，易溶于氯仿、甲醇和二甲基亚砜等中等极性溶剂，能溶于水，在紫外光照射下产生荧光。农产品中的黄曲霉毒素主要以4种常见形式污染食品，即黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)，其中，以AFB1最为常见，毒性最强[5]。

笔者以油茶籽及其饼粕为试材，采用不同极性的溶剂进行提取，对所得粗提物抑制黄曲霉生长的效果进行了较为系统的研究，其目的就是要从中筛选出对黄曲霉生长有较好抑制效果的粗提物，并掌握其提取工艺与条件，为进一步分离与提纯，了解并掌握其具体的功效成分与作用机理，进而为油茶生产实践与加工利用中更好地预防黄曲霉的污染，有效降低黄曲霉毒素对人体的危害等提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料原料：油茶籽，取自于浙江地区的普通油茶籽，新鲜，完整，无霉变腐烂等；油茶粕，为油茶籽榨油后剩余的油茶饼；黄豆，购于当地农贸市场，产于浙江地区的普通黄豆，新鲜，完整，无霉变腐烂等；花生，购于当地农贸市场，产于浙江地区的普通花生，新鲜，完整，无霉变腐烂等。

主要仪器：旋转蒸发仪RE-52A，上海亚荣生化仪器厂；普通水浴锅；生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜，苏州苏净安泰空气技术有限公司；Agilent1290高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；LDZF-30KB立式蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2方法

1.2.1人工接种黄曲霉菌的试验。分别称取油茶籽、油茶粕、黄豆、花生4种材料，放置于热风烘干箱中60 ℃烘干12 h,放入干燥器中冷却至室温，各称取300 g，粉碎过20目筛，然后用湿热灭菌法灭菌，接种黄曲霉(用配制好的黄曲霉孢子悬浮液进行接种，黄曲霉孢子悬浮液的浓度为1×106CFU/mL，每个平板接种黄曲霉孢子悬浮液5 mL)。在30 ℃培养箱中培养20 d，每4 d取样1次，进行观察，观察4种试验材料接种黄曲霉后的感染及生长情况，并测定各样品中AFB1的含量。

1.2.2油茶籽和油茶粕粗提物抑制黄曲霉生长的试验。选取无霉变感染的油茶籽、脱脂后的油茶粕于60 ℃烘干，粉碎后过20目筛，分别用不同极性的溶剂(乙醚、80%乙醇、水)加热回流提取。料液比1∶5 g/mL，每种溶剂重复提取3次，时间分别为3、2、1 h，将每种溶剂3次所得提取液合并、浓缩，将提取液放置于铝盒中，在热风干燥箱中60 ℃烘干至恒重，称重，计算粗提物得率。

用无菌水将各油茶籽粗提物配制成400 mg/mL的水溶液。用灭菌枪头吸取黄曲霉孢子悬液0.5 mL，均匀涂布于PDA平板上，每个平板上放直径6 mm的无菌滤纸片3片，每个纸片滴加0.05 mL粗提物，每处理做3个重复。

1.2.3检测方法。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2由国家林业局经济林产品质量检验检测中心采用国家标准GB/T18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定》进行检测。

2结果与分析

2.1不同试样感染黄曲霉毒素的情况黄曲霉一般在25～30 ℃生长较好[6]，以油茶籽、油茶粕为材料，以黄豆、花生为对照，人工接种黄曲霉，在30 ℃的恒温培养箱中进行培养，每4 d取样1次，及时对所取样品所含AFB1的含量进行测定，结果见表1。

从表1中可以看出，在人为接种黄曲霉的情况下，油茶籽和油茶粕均未产生黄曲霉毒素B1，花生的5个批次样品中都产生了黄曲霉毒素B1。从表1可知，花生中AFB1的含量随着时间的延长逐渐增加，呈上升趋势；油茶籽和油茶粕在5次提取的样品中并未检测到AFB1。笔者推测认为，油茶籽和油茶粕中含有某些成分对黄曲霉的生长产生一定的抑制作用，进而减少AFB1的产生，甚至是不产生AFB1。

表1　不同试样产生黄曲霉毒素B1的含量

注：AFB1的检出限为1.0 μg/kg。

Note: Detection limit of AFB1 was 1.0 μg/kg.

2.2不同溶剂提取对油茶籽和油茶粕粗提物得率的影响按试验设计要求，将油茶籽粉、油茶粕粉放置于烘箱中60 ℃烘干，准确称量烘干的油茶籽和油茶粕各40 g，各3份，分别置于不同的提取瓶中，分别用纯净水、80%乙醇、乙醚作为提取剂，溶剂加入量为200 mL，然后均采用热回流提取法[7]提取3次，提取的时间分别为3、2和1 h，将3次所得提取液混合，并置于50 ℃烘箱中烘干至恒重，称量，计算结果见表2。

表2　不同溶剂提取油茶籽、油茶粕粗提物的得率

由表2可知，采用不同极性的溶剂来提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是完全不同的，有明显差异。其中，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，达57.74%；其次是用纯净水提取的油茶籽粗提物的得率，可达38.90%；油茶籽80%乙醇的提取率较低，为18.42%；最低的是用乙醚作为提取剂，提取油茶粕中的粗提物，其得率仅为0.27%；而油茶粕中的粗提物，不论是用纯净水提取，还是用80%乙醇提取，其得率均在22%左右。

2.3油茶籽和油茶粕粗提物对黄曲霉的抑制效果按“1.2.2”的方法测量抑菌圈直径，计算抑菌率[8]，具体结果如表3所示。

从表3中可以看出，油茶籽和油茶粕的水提物对黄曲霉的生长有较好的抑制效果，抑菌率分别达到88.87%和87.96%，两者的差异并不明显，均可用于抑制黄曲霉的生长，相对来说，采用油茶粕的水提物更为经济、实用。油茶籽的乙醚提取物对黄曲霉的生长也有一定的抑制作用，抑菌率可达61.11%，也可适当予以应用。油茶籽和油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物对黄曲霉的生长都没有抑制效果。

从图1、2可以看出，在恒温培养4 d后，PDA平板上的黄曲霉已经大量生长，而在有粗提物的滤纸片的周围，只生长了少量的白色菌丝，说明油茶籽和油茶粕的水提物能够明显减缓黄曲霉的生长。

表3　油茶籽和油茶粕粗提物对黄曲霉的抑制效果

注：“/”为没有抑制效果。

Note: “/” indicated no inhibitory effects.

图1　油茶籽水提取物抑制黄曲霉的效果Fig. 1　Inhibitory effects of water extracts from camellia seed on Aspergillus flavus

图2　油茶粕水提取物抑制黄曲霉的效果Fig. 2 Inhibitory effects of water extracts from seed cake on Aspergillus flavus

从图3可以看出，油茶籽的乙醚提取物在培养皿中也形成较明显的抑菌圈，表明它同样能抑制黄曲霉的生长。

图3　油茶籽乙醚提取物抑制黄曲霉的效果Fig. 3　Inhibitory effects of diethyl ether extracts from camellia seed on Aspergillus flavus

至于上述这3种粗提物中究竟是哪一种活性物质在起抑菌作用，还是多种活性物质协同作用的结果，笔者认为还需要进一步的分离提纯，并进行大量的验证试验才能逐步确定。

3结论与讨论

试验中发现，在人为接种黄曲霉的情况下，油茶籽、油茶粕均未产生黄曲霉毒素B1，表明油茶籽、油茶粕都具有一定的抗黄曲霉生长与产毒作用。

研究结果表明，采用不同极性的溶剂来提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是完全不同的，有明显差异。其中，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，达57.74%；其次是用纯净水提取的油茶籽粗提物的得率，可达38.90%；油茶籽80%乙醇的提取率较低，为18.42%；最低的是用乙醚作为提取剂提取油茶粕中的粗提物，其得率仅为0.27%；而油茶粕中的粗提物，不论是用纯净水提取，还是用80%乙醇提取，其得率均在22%左右。

进一步研究发现，用不同溶剂来提取油茶籽、油茶粕所得的不同粗提物，对黄曲霉生长的抑制效果截然不同。其中，油茶籽、油茶粕的水提物对黄曲霉生长的抑制效果较好，其抑菌率分别达到88.87%和87.96%，两者的差异并不明显；油茶籽的乙醚提取物对黄曲霉的生长也有一定的抑制作用，其抑菌率可达61.11%；而油茶籽、油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物对黄曲霉的生长都没有抑制效果。

从油茶籽、油茶粕中提取所得的不同粗提物内，对黄曲霉的生长起抑制作用的成分，到底是哪一种活性物质，还是多种活性物质协同作用的结果，还有待于做进一步的分离提纯，及大量的验证试验。

参考文献

[1] 姚小华.油茶资源与科学利用研究[M].北京:科学出版社, 2012:1.

[2] 尹岭,张笑明, 李莉，等.茶油对兔血脂及动脉粥样硬化的影响[J].食品科学,2011,32(7): 289-290.

[3] 中国粮油学会油脂分会.对“油茶籽油苯并(a)芘超标质量事件”有关问题的意见[J].中国油脂，2010,35(11):22.

[4] 蔡静平.真菌对食品安全性的影响[J].粮油食品微生物学，2003(1):296-301.

[5] 丁丁.香菇多糖及其衍生物抑制 AFB1合成及其抑制机理研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.

[6] 王守经，祝清俊，胡鹏. 花生及其制品的黄曲霉毒素污染与防控措施[J].中国食物与营养，2010(3):14-16.

[7] 郝彩琴，冷晓红，郭鸿雁，等.不同提取方法对宁夏六盘山栽培秦艽中龙胆苦苷提取率的影响[J].西北药学杂志，2013,28(1)：13-15.

摘要[目的] 从油茶籽及其饼粕中筛选出对黄曲霉生长有较好抑制效果的粗提物，并掌握其提取工艺与条件。[方法]以油茶籽及其饼粕为试材，采用不同极性的溶剂进行提取，对所得粗提物抑制黄曲霉生长的效果进行系统的研究。[结果]试验表明，油茶籽、油茶粕都具有一定的抗黄曲霉生长与产毒作用。用不同溶剂提取油茶籽、油茶粕中的粗提物，其得率是有明显差异的，用乙醚提取的油茶籽粗提物的得率最高，达57.74%；其次是用纯净水提取的油茶籽粗提物的得率，可达38.90%；最低的是用乙醚作为提取剂提取的油茶粕粗提物，其得率仅为0.27%。粗提物不同，对黄曲霉生长的抑制效果也不同，其中，油茶籽、油茶粕的水提物对黄曲霉生长的抑制效果较好，其抑菌率分别达到88.87%和87.96%；油茶籽的乙醚提取物也有一定的抑制作用，其抑菌率可达61.11%；而油茶籽、油茶粕的乙醇提取物，以及油茶粕的乙醚提取物对黄曲霉的生长都没有抑制效果。[结论] 研究可为油茶生产与加工利用中更好地预防黄曲霉的污染，有效降低黄曲霉毒素对人体的危害等提供一定的理论依据。

关键词油茶籽；油茶粕；黄曲霉；抑制

Antagonistic Effects of Camellia Seed and Seed Cake onAspergillusflavus

ZHANG Fei-fei1,2, WANG Ya-ping1*, YAO Xiao-hua1et al (1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang, Zhejiang 311400; 2. School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang 311300)

Abstract[Objective] To screen the crude extracts from camellia seed and seed cake which had relatively good inhibitory effects on the growth ofAspergillusflavus, and to grasp the extraction technology and conditions. [Method] With camellia seed and seed cake as the research materials, extraction was carried out by solvents with different polarities. Systematic study of the antagonistic effects of camellia seed and seed cake onA.flavuswas carried out. [Result] Both camellia seed and seed cake had certain effects of toxin production and resistance effects onA.flavusgrowth. The extraction rates of crude extracts from camellia seed and seed cake varied greatly by different solvents, showing significant differences. Among them, crude extracts from camellia seed by diethyl ether had the maximum extraction rate (57.74%), followed with the crude extracts from camellia seed by purified water (38.90%). Crude extracts extracted by diethyl ether had the minimum extraction rate, which was only 0.27%. Different crude extracts showed different inhibitory effects on the growth ofA.flavus. Among them, water extracts from camellia seed and seed cake had relatively good inhibitory effects on the growth ofA.flavus. And their inhibitory rates reached 88.87% and 87.96%, respectively. Extracts from camellia seed by diethyl ether also had certain inhibitory effects, and the inhibitory rate reached 61.11%. Extracts from camellia seed and seed cake by ethanol showed no inhibitory effects on the growth ofA.flavus, as well as the extracts from seed cake by diethyl ether. [Conclusion] This research provides certain theoretical foundation for the prevention ofA.flavuspollution during production and process of camellia, and effectively reduces the damage ofA.flavusto human body.

Key wordsCamellia seed; Seed cake;A.flavus; Inhibition

收稿日期2015-10-30

作者简介张飞飞(1988- )，女，山东五莲人，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全研究。*通讯作者，助理研究员，硕士，从事经济林产品的加工与利用研究。

基金项目国家自然科学基金项目(31400577)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(CAFYBB2014QB036)。

中图分类号S 789.5

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-108-04