VEGFR基因表达与接受恩度治疗的Ⅲa期非小细胞肺癌疗效相关性研究*

杨晓军，李 强△，庄 翔，何金涛，周红艳，朱 江，谢天鹏，肖 平，荣 昊

（1.四川省肿瘤医院胸外科，成都610041；2.四川省肿瘤医院科教部，成都610041）

VEGFR基因表达与接受恩度治疗的Ⅲa期非小细胞肺癌疗效相关性研究*

杨晓军1，李 强1△，庄 翔1，何金涛1，周红艳2，朱 江1，谢天鹏1，肖 平1，荣 昊1

（1.四川省肿瘤医院胸外科，成都610041；2.四川省肿瘤医院科教部，成都610041）

目的：探讨Ⅲa期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者肿瘤组织中血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）mRNA表达水平与重组人血管内皮抑制素注射液（商品名恩度，Endostar）辅助治疗疗效的相关性。方法：通过分支DNA－液相芯片法检测29例Ⅲa期NSCLC患者组织中VEGFR mRNA表达水平，分析VEGFR1和VEGFR2基因mRNA表达水平与手术后接受恩度联合GP方案化疗患者复发转移的相关性。结果：以1年复发转移率为本研究终点，VEGFR1在复发转移组中的表达范围4.0%～86.0%，中位表达48.9%；无复发转移组中的表达范围16.1%～73.5%，中位表达52.6%，差异有统计学意义（Z＝2.225，P＝0.013）。VEGFR2在无复发转移组中的表达范围1.0%～93.0%，中位表达46.9%；复发转移组中的表达范围11.7%～72.6%，中位表达36.2%，差异有统计学意义（Z＝2.12，P＝0.017）。结论：Ⅲa期NSCLC肿瘤组织中VEGFR mRNA高表达的患者在接受恩度辅助治疗后复发转移率更低，提示VEGFR mRNA表达水平可作为恩度的疗效预测因子，可作为筛选恩度辅助治疗获益人群的指标。

非小细胞肺癌；Ⅲa期；血管内皮生长因子受体1；血管内皮生长因子受体2；血管内皮抑制素

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占全部肺癌的80%左右，大约30%的NSCLC患者在最初诊断时已经处于局部晚期（Ⅲa期/Ⅲb期），而Ⅲ期NSCLC切除术后的5年生存率仅为13%～36%，所以Ⅲ期肺癌的治疗一直是肺癌治疗领域的难点［1－2］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被公认是最重要的促进血管新生的因子之一，其受体VEGFR1、VEGFR2与血管的生成关系密切，是目前抗血管生成抑制剂的主要靶点［3］。常见的血管抑制剂类药物有单抗类的贝伐单抗和多靶点的小分子抑制剂索拉菲尼等。重组人血管内皮抑制素（恩度）是中国自主研发的一类新药，其作用机理是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移来达到抑制肿瘤新生血管的生成，从而阻断了肿瘤的营养供给，达到抑制肿瘤增殖或转移目的。作为一种血管抑制类新生物制品，该药已经作为联合化疗用药广泛应用于晚期肺癌的综合治疗，也为Ⅲa期肺癌的辅助治疗带来了一定的进展。

恩度通过诱导血管内皮细胞凋亡，细胞周期阻滞等来破坏肿瘤中的血管结构，抑制肿瘤血管的生成，从而切断肿瘤的血液供应来达到抑制肿瘤的目的。所以恩度潜在的疗效预测因子可能与血管内皮生长因子受体相关，即VEGFR基因mRNA表达也许能预测恩度的疗效。因此，本研究拟对接受含恩度治疗的Ⅲa期非小细胞肺癌患者进行VEGFR基因mRNA表达水平的研究，以1年复发转移率为终点评价指标［3］，探寻VEGFR基因mRNA表达水平与恩度治疗疗效的相关性，为Ⅲa期肺癌患者的个性化辅助治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2011年11月至2013年3月就诊于四川省肿瘤医院胸外科，经过病理学及影像学确诊为Ⅲa期的NSCLC患者29例，年龄42～80岁，中位年龄60岁。腺癌18例，鳞癌9例，腺鳞癌2例；男性19例，女性10例。所有患者行根治性手术，患者身体状况评分ECOG 0～1，既往未接受过放化疗，术后辅助治疗前检查结果证实患者的血常规、肝功能、肾功能及心脏功能等均在正常范围值内。术后采用吉西他滨（1 250mg/m2，d1）+顺铂（80～120mg/m2，d1）+恩度（7.5mg/m2，d1－14d）方案化疗。化疗方案的周期间隔21天，共进行4个周期化疗。

1.2 方法

1.2.1 检测肿瘤组织中VEGFR mRNA表达水平

采用分支DNA－液相芯片技术。所有患者获取的肿瘤石蜡块组织进行VEGFR mRNA表达检测：1）标本用75%乙醇固定，取适量样本加入裂解液，56℃下裂解反应2小时；2）将样本裂解液转移至孵育板上，加入支持探针－微球、支持延伸探针、缓冲液，55℃震荡孵育过夜；3）次日将孵育板放在磁力架上1分钟，此时磁性微球聚集在底部，吸取弃去上清；4）加入洗涤液，震荡洗涤1分钟，孵育板放在磁力架上1分钟，吸取弃去上清，重复洗3次；5）加入扩增延伸探针和标记探针，50℃震荡反应1小时；6）孵育板放在磁力架上1分钟，吸取弃去上清，用洗涤液洗2次；7）加入链霉亲和素－藻红蛋白，50℃震荡反应30分钟；8）孵育板放在磁力架上1分钟，吸取弃去上清，用洗涤液洗2次；9）加入洗涤液，震荡5分钟，于Luminex阅读仪上读取数据；10）数据分析，得出检测结果。

1.2.2 检测结果的表现形式及判定 患者的基因表达水平检测数据显示的百分比为患者该基因表达水平在同类癌种人群中所处的位置，即所得的数值是患者基因表达水平在整个肺癌人群中的分布情况，以表明该患者在整个肺癌人群中处于怎样的水平，可划分为低、中、高三个表达水平，采用四分位法且合并，＜37.5%为低表达；37.5%～62.5%为中表达；＞62.5%为高表达，参考益善生物检测人群数据库，数据库为数千例的中国肺癌人群数据库。

1.3 统计学分析

以1年复发转移率为研究终点，出现复发或转移的患者称为复发转移组，而无复发或转移的患者称为无复发转移组，用非参数检验法比较VEGFR1和VEGFR2在复发转移组与非复发转移组的表达差异是否有统计学意义，即采用计数资料t检验，应用SPSS 17.0软件进行分析，检验水准P＜0.05，均为双侧检验有意义。

2 结 果

2.1 VEGFR1和VEGFR2基因m RNA表达水平

在29例Ⅲa期NSCLC患者肿瘤组织样本检测了VEGFR1和VEGFR2基因的mRNA表达水平。VEGFR1低表达11例（37.9%），中表达8例（27.6%），高表达10例（34.5%）。VEGFR2低表达13例（44.8%），中表达10例（34.5%），高表达6例（20.7%）。

2.2 VEGFR1和VEGFR2基因mRNA表达与恩度疗效的相关性

以1年复发率为疗效评估指标，随访期内，有7例（24.1%）出现复发或转移，其中复发4例，脑转移2例，骨转移1例。VEGFR1在复发转移组中的表达范围4.0%～86.0%，中位表达48.9%；无复发转移组中的表达范围16.1%～73.5%，中位表达52.6%，VEGFR1在复发转移组和无复发转移组中表达差异有统计学意义（Z＝2.225，P＝0.013）。VEGFR2在复发转移组中的表达范围11.7%～72.6%，中位表达36.2%；无复发转移组中的表达范围1.0%～93.0%，中位表达46.9%；VEGFR2在复发转移组和无复发转移组中表达差异有统计学意义（Z＝2.12，P＝0.017）。

图1 VEGFR1 mRNA在无复发转移组和复发转移组中的表达水平

图2 VEGFR2 mRNA在无复发转移组和复发转移组中的表达水平

3 讨 论

虽然辅助治疗可能消灭残存的微小转移病灶，减少肿瘤复发和转移的机会，但是根据临床结果显示，术后接受辅助治疗的肿瘤患者的治疗有效率仍然有限，多数患者接受的化疗疗效甚微，而且有时毒副作用对患者会产生不良影响。所以，寻找药物疗效预测的生物标记从而选择患者接受合适的治疗，在提高治疗有效率的同时，尽量减少不必要的化疗毒副作用的困扰是十分有意义的。近年来，药物遗传学和药物基因组学在化疗药物作用机制等方面的研究取得了突破性进展，相关的临床研究也不断深入。先通过相关基因的检测，再根据检测结果选择合适的药物进行个体化治疗，或将成为肿瘤治疗的一种发展趋势。

肿瘤生长需要依赖肿瘤血管的生成，所以通过抑制肿瘤新生血管可以达到控制肿瘤的目的。VEGF是肿瘤新生血管形成的最有效和最特异的因子，它可以促进血管内皮细胞分裂增殖，增加微静脉和小静脉的通透性，VEGF表达在肿瘤生长和转移中具有十分重要的作用。VEGFR是VEGF的受体，VEGF和VEGFR结合后可引发内皮细胞的一系列变化，促进肿瘤血管生成、浸润和转移。疗效预测方面，VEGFR1 mRNA表达水平检测对结直肠癌患者接受抗血管生成抑制剂治疗具有明显的指导意义。Dan等［4］一项对接受贝伐单抗联合化疗治疗的局部直肠癌患者的研究中，发现血浆可溶性VEGFR1水平（sVEGFR1）与接受贝伐单抗联合放化疗的新辅助治疗后的原发灶缩小和副作用的发展相关，推测血浆中sVEGFR1的表达水平是贝伐单抗和/或新辅助治疗中细胞毒副作用的生物标志物。该研究表明，VEGFR基因表达与抗血管生成抑制剂的疗效呈现相关关系。而在肺癌中VEGFR2的过表达会促进肿瘤的发生发展，导致更差的预后［5］。本研究报道了VEGFR基因表达与含恩度的Ⅲa期肺癌辅助治疗疗效的相关性。研究结果显示VEGFR1和VEGFR2基因高表达的患者在接受恩度辅助治疗后复发转移率更低，样示VEGFRmRNA表达水平可能是血管内皮抑素恩度潜在的疗效预测因子，其表达量的高低影响患者术后接受恩度联合GP辅助治疗后1年复发转移率。基于本研究的观察结果，表明VEGFR基因表达与血管抑制剂的疗效具有一定相关性，为恩度等血管抑制剂的敏感人群筛选提供了一个新的思路和方向。

本文采用的实验方法为分支DNA－液相芯片技术，它是一种广泛应用于临床的基因表达检测技术，在基因检测方面与传统方法无论是RT－PCR还是固相芯片比较都有明显优势。样本无论是新鲜组织还是石蜡包埋块组织都可以进行mRNA表达水平检测，整个过程中无需进行RNA抽提、纯化和逆转录等步骤即可实现对mRNA表达水平的直接检测，检测结果基本不受样品中RNA降解等因素的影响，相比于传统的实时荧光定量PCR，更保证了检测结果的准确性［6］。

鉴于本研究样本量少，且为回顾性研究，入组患者随访时间较短，无法就患者生存预后状况做出有力的统计学证明。因此有必要进行长期的随访研究比较不同VEGFR表达水平的患者的临床疗效差异。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任。

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突。

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网（CNKI）科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测。

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

［1］ NK Veeramachaneni，RH Feins，BJ Stephenson，et al.Management of stage ⅢA non-small cell lung cancer by thoracic surgeons in north america［J］.Ann Thorac Surg，2012，94（3）：922－926.

［2］ 刘慧慧，王孟昭，胡 克，等.Ⅲ期非小细胞肺癌手术是否有价值［J］.中国肺癌杂志，2013，16（12）：639－645.

［3］ 李春鸣，余更生.肺癌术后局部复发和远处转移相关因素的差异性分析［J］.当代医学，2013，19（24）：9－10.

［4］ Dan GD，Willett CG，Ancukiewicz M，et al.Plasma soluble VEGFR－1 is a potential dual biomarker of response and toxicity for bevacizumab with chemoradiation in locally advanced rectal cancer［J］.Oncologist，2010，15（6）：577－583.

［5］ 蒋晓东，戴 鹏，宋大安，等.HIF－1a、VEGF、VEGFR2在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义［J］.临床肺科杂志，2011，16（3）：386－388.

［6］ 胡艳正，王 伟，尚立群，等.液相芯片与免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌ERCC1和RRM1表达的比较研究［J］.中国肿瘤临床，2013，12（6）：349－353.

R734.2；R730.5

B

10.3969/j.issn.1674-0904.2016.06.005

2015-05-14

2016-11-17

*四川省科技支撑计划（编号：2011FZ0069）

杨晓军（1969－），男，四川人，本科，副主任医师，主要研究方向：肺癌的综合治疗。

△李 强，主任医师，E-mail：liqiang201320＠163.com