植物螯合肽合成酶的催化机制研究进展

张妍茹++佟少明++侯和胜

摘 要：植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase，PCS）可在重金属离子激活下，以谷胱甘肽（GSH）及其巯醇盐为双底物催化合成植物螯合肽（phytochelatins，PCs），从而解除生物体内重金属的毒性。远源同源蛋白分析揭示了PCS属于木瓜蛋白酶超家族，其催化机制类似于Cys蛋白酶。

关键词：植物螯合肽合成酶；催化机制；重金属离子

中图分类号：Q946.5 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.02.005

Research Progress of Catalytic Mechanism of Phytochelatin Synthase

ZHANG Yanru， TONG Shaoming， HOU Hesheng

（School of Life Science， Liaoning Normal University， The Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province， Dalian， Liaoning 116081， China）

Abstract： Activated by heavy metal ions， phytochelatin synthase（PCS） catalyzes the synthesis of plant phytochelatins（PCs） using GSH and related thiols as bisubstrate， which contributes to heavy metal detoxification. Analysis of distant homologous protein revealed that the PCS belongs to papain protein superfamily and its catalytic mechanisms were analogous to Cys protease.

Key words： phytochelatin synthase； catalytic mechanism； heavy metals

近年来，由于人类对重金属需求不断增加，致使针对于重金属的开采、冶炼、加工等活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，在引起严重环境污染的同时，对生物体的生长及发育等造成严重的影响。一般而言，细胞对于重金属离子的解毒作用是通过合成具有高亲和性结合位点的螯合剂，来抑制重金属与生物功能分子中重要功能基团的结合。研究表明，在高等植物中分离最多的重金属螯合肽是PCs，PCs具有解除重金属对植物细胞的毒害以及维持细胞内必需金属离子浓度相对稳定的作用[1]。

1 PCs和PCS

PCs在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和蛇根草（Rauvolfia serpentine）细胞悬浮液中首次发现[2-3]，随后在真菌、藻类、维管植物及无脊椎动物中陆续发现[4-6]。PCs具有（γ-Glu-Cys）n Xaa（n=2-11，Xaa通常是Gly）的典型结构，是在γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基转肽酶（γ-glutamylcysteine dipeptidyltranspeptidase），即植物螯合肽合成酶（phytochelatin synthase，PCS）催化下合成的[7]。PCS催化GSH合成PCs活性是Grill等[8]在悬浮培养的植物细胞中首次发现，随后，Grill等[9]又从麦瓶草的悬浮培养细胞中分离纯化出具有活性的PCS。从1999年开始，研究者先后从植物、真菌[7，10]和无脊椎动物[11-12]中成功克隆到PCS基因。序列分析表明该基因编码蛋白的分子量为42～70 KDa，N端序列保守，相似性高达40%～50%，C末端序列多变。

2 PCS的催化机制

2.1 重金属离子激活PCS的催化活性

Grill等人的体外活性实验结果表明，PCS只有在金属离子存在时才有催化活性，且在所测试的金属中Cd2+激活效果最好，Pb2+、Zn2+、Cu2+、Sb3+、Ag+、Hg2+和一些其他离子也可激活PCS。该结论被纯化的拟南芥AtPCS1所证实。这种依赖金属离子的PCs合成反应被认为是一种通过反应产物捕获激活离子的自我终止反应。

最初，研究者认为重金属离子对于真核PCS的激活是通过其直接结合于该酶N端保守结构域中的Cys残基上实现的[6]。然而，后期研究表明，反应中重金属离子结合底物而不直接结合酶。Vatamaniuk等人[14]通 过AtPCS1-FLAG催化动力学分析直接证明了酶的激活不是与游离Cd2+直接结合，而是通过Cd2+与底物GSH结合形成Cd-GS2 复合物来激活AtPCS1。在Cd-GS2复合物中，Cd2+与GSH中巯基结合，阻塞巯基活性。进一步的研究表明，如果以阻塞巯基的GSH衍生物作为底物，例如用S-烷基-GSH作为底物合成S-烷基-PCs，AtPCS1在缺少金属离子的培养基中，仍显示出高催化效率，证明了在没有重金属的情况下，阻塞的巯基也足够激活PCS。这暗示了PCS催化活性的决定性因素是提供含巯基被阻塞的GSH类似物。

关于真核PCS如何被金属离子激活，研究者提出金属离子可能从GS-金属复合物转移到PCS蛋白，从而激活它。如上所述，细胞中游离的Cd2+不可直接与酶结合。然而，PCS蛋白携带高亲和性的结合位点，金属离子可以从低分子量配体转移到PCS蛋白。通过肽扫描技术，研究者检测到Cd2+可与PCS蛋白结合。因而，目前认为金属离子是从GS-金属复合物转移到PCS蛋白，从而激活酶的活性。