小麦收购过程中呕吐毒素检测方法的探讨

徐存宽　薛云才　孙宝胜

泰州市粮油质量监测所　江苏泰州　225300

小麦收购过程中呕吐毒素检测方法的探讨

徐存宽薛云才孙宝胜

泰州市粮油质量监测所江苏泰州225300

目前对呕吐毒素国内常用的检测方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫检测试剂盒和胶体金快速定量法等。胶体金快速定量法无需大型仪器、检测速度快、成本较低，但精度较低，这在小麦收购现场是可以接受的，比较适合于收购粮食过程中呕吐毒素的现场快速检测，控制好入库小麦的呕吐毒素含量。

小麦呕吐毒素检测

呕吐毒素主体成分为DON（deoxynivalenol，脱氧雪腐镰刀菌烯醇），属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素。研究表明，DON化学性能非常稳定，一般不会在加工、储存以及烹调过程中破坏，121℃高压加热25min仅有少量破坏，烘焙温度210℃，油煎温度140℃、或煮沸，只能破坏50%。含有呕吐毒素谷物类加工产品，在加工过程中，由于技术限制不可能完全去除，人食用含有一定量呕吐毒素粮油食品后，会出现胃部不适、眩晕、腹胀、头痛、恶心、呕吐，手足发麻、全身乏力、颜面潮红、以及食物中毒性白细胞缺乏症。呕吐毒素主要通过胃肠道吸收，经血液循环进入肝脏代谢后经肾脏随尿液排出，造成各器官的广泛损伤。它在人体中的半衰期为2～4h，代谢迅速，8h后就检测不到呕吐毒素和它的代谢物。

呕吐毒素可在人和动物体内蓄积，具有致畸性、神经毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。呕吐毒素的产毒菌株适宜在阴凉、潮湿的条件下生长，广泛存在于大麦、小麦、玉米和燕麦中。

我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定，小麦粉、小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准为1000μg/kg。

由于呕吐毒素对人体具有较大的伤害，近年来相关部门加大了对市场中面粉等食品的呕吐毒素含量检测，在检测中一些面粉加工企业的部分批次产品被检出呕吐毒素含量超标，相关产品面粉加工企业只能回收处理，给企业造成较大的损失。而面粉中的呕吐毒素主要来自于小麦，且在面粉加工过程中，对呕吐毒素没有有效的去除方法，只能通过控制小麦中的呕吐毒素含量来保证面粉中的呕吐毒素含量不超标。因此面粉加工企业纷纷加强了对采购小麦的呕吐毒素含量控制。

从保障人民健康、食品安全的角度来看，作为粮食收购第一线的粮库，在小麦的收购过程中就应控制好入库小麦的呕吐毒素含量。目前，粮库在收购过程中主要是通过控制小麦样品的赤霉病率，来间接控制呕吐毒素含量，这种方法准确性较差，特别在赤霉病高发的年份，更是难以操作。目前对呕吐毒素国内常用的检测方法主要有以下几种：高效液相色谱法、酶联免疫检测试剂盒、胶体金快速定量法等。

1　高效液相色谱法

1）主要仪器与试剂

高效液相色谱仪；天平（感量0.001g）；粉碎机；均质器；精密移液器；免疫亲和柱；甲醇；聚乙二醇。

2）呕吐毒素标准溶液的配制

临用前将10mg/kg储存标准品，用流动相逐步稀释配置成适当浓度的标准溶液。

3）色谱条件

C18色谱柱（150mm×4.6mm）；流动相：甲醇+水（20+80）；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：50μL，检测波长：218nm。

4）提取净化

准确称取25.00g均匀样品于250mL规格具塞三角烧瓶中，加5.00g聚乙二醇，加125mL去离子水，于往复式振荡器剧烈震荡20min。用快速滤纸过滤，收集滤液（≥10mL）于15mL刻度塑料离心管中；再将滤液经微纤维滤纸过滤，收集滤液于新塑料离心管中作为上样液。取2.5mL上清液以1～2滴/s的速率将其通过免疫亲和柱，直至空气吹出柱内的全部液体，再用10mL去离子水以1～2滴/s的速率洗涤亲和柱，直至空气吹出柱内的全部液体。最后用2mL甲醇以1滴/s流速的淋洗亲和柱，收集滤液于玻璃试管中，在50～60℃加热条件下氮气吹干，然后用流动相复溶。用高效液相色谱进行测定，根据峰保留时间定性，根据峰面积外标法定量。

高效液相色谱法检测呕吐毒素的优点是：检测的准确性高，李辉章等人的研究结果显示，呕吐毒素在0.5～8.0mg/kg内线性关系好，相关系数为0.999；在0.5、2.0和8.0mg/kg的加标水平下，回收率为95.1%～102.3%，相对标准偏差为1.8%～6.4%。缺点是：需要使用大型仪器；检测中使用的耗材成本高；整个检测过程大概需要3～4h，相对于收购而言检测时间过长。所以高效液相色谱法适用对大批量小麦呕吐毒素含量的精确测定。

2　酶联免疫检测试剂盒

酶联免疫检测试剂盒是利用间接酶联免疫进行检测。样品中游离的呕吐毒素与包被在微孔中的抗原竞争结合游离单克隆抗体上的结合位点，形成抗原体结合物，经洗板后，加入酶标记的二抗与单克隆抗体结和，经再次洗板后加入显色剂与反应底物，其与酶标物作用而成蓝色，加入反应停止液后颜色由蓝色转变为黄色，黄色越深则表明呕吐毒素越少.用酶标仪在450nm处测定光吸收值，从而定量检测样品中的呕吐毒素污染水平。

1）主要仪器与试剂

酶标仪、恒温培养箱、移液器、呕吐毒素酶联免疫检测试剂盒。

2）测定步骤

①根据样品检测数插入相应数量的酶标板微孔于反应板支架上，标记好标准品孔和样品孔，然后加入200μL左右稀释好的洗涤液，放置lmin，倒掉液体后拍干。

②在标准品孔中加入50μL各浓度的标准品，在样品孔中加入50μL样品液。每孔都加入50μL稀释后的DON抗体溶液，混合摇匀，在37℃恒温箱中孵育60min。

③孵育结束后甩掉微孔中的液体，然后每孔加入250μL稀释后的洗涤波，放置lmin倒掉液体，重复洗涤3次，倒掉液体后用力拍干。每孔加入l00μL稀释后的酵标二抗溶液，在37℃恒温箱中孵育30min。

④孵育结束后甩掉微孔中的液体，每孔加入250μL稀释后的洗涤波，放置lmin倒掉液体，重复洗涤3次，倒掉液体后用力拍干。每孔分别加入50μL显色剂和50μL反应底物，轻轻摇匀，在37℃恒温箱中显示反应15min。

⑤显色反应结束后每孔加入50μL终止液，用酶标仪在450nm处进行测定（必须在加入终止液后10min内完成测定）。

⑥用酶标仪在450nm处测得标准品孔的光吸收值（A）以及对应浓度绘制标准曲线.通过标准曲线，定量样品中呕吐毒素含量。

酶联免疫法测呕吐毒素的优点是：检测中不需要使用大型仪器；检测的成本较低。缺点是：检测的准确性低，杨丹妮等人的研究结果表明，小麦样品提取后直接过滤后进行ELISA检测的回收率较高，在75%以上，相对标准偏差（RSD）在 4.7%～10.6%，酶联免疫法检测的准确性低于高效液相色谱法。检测过程中需要进行精确加注试剂，恒温箱孵化，洗板等过程，操作比较繁琐，整个检测过程需要2～3h，不太适用收购现场检测。

3　胶体金快速定量法

本文的胶体金快速定量法是以charm公司的ROSAFAST5呕吐毒素快速定量检测条为例。快速定量检测条法的原理为免疫层析法，使用水提取样品中的呕吐毒素，提取物与有颜色的微粒反应，以读数仪读取检测区的颜色强度，并将结果换算为样品中的呕吐毒素浓度。

1）主要仪器与试剂

ROSA孵育器（45℃）、ROSA-M读数仪、离心机、天平、FAST5呕吐毒素快速定量检测条。

2）样品制备

称取10g混匀后的样品至干净的锥形瓶中，加入50mL去离子水；剧烈震荡30s后静置1min，获得提取物；用一次性吸管吸取1mL提取物至离心管中，离心机5000r/min速度，离心1min；移取100μL离心后的提取液至干净的离心管中，加入1mL DONQ-FAST5稀释缓冲液，即“稀释的提取液”；移取300μL稀释的提取液至干净的离心管中，加入1mLDONQ-FAST5稀释缓冲液混匀，即2次稀释的提取液。

3）检测步骤

将检测条放入ROSA-M孵育器，平底一侧朝上。一边使检测条保持在孵育器内，一边小心揭开粘膜至指示线处，使样品槽暴露；移液器保持竖直，加入300uL稀释的提取液至样品室，重新封上粘膜；操作下一检测条盖上孵育器盖子并锁定，红色计时指示灯亮，开始倒计时；孵育器孵育5min，不要超过7min；取出检测条，判读检测是否有效，判读结果之前，将检测条样品室一端向下放置。将干净，有效的检测条插入ROSA-M读数仪；选取DON频道，并选择相应的样品类型（MATRIX01），按ENTER读取结果。MATRIX01：检测的范围为1000～6000μg/kg，比较适合于小麦现场收购的呕吐毒素检测。

胶体金快速定量法检测呕吐毒素的优点是：检测中不需要使用大型仪器；检测的速度快，在操作熟练的基础上样品可在10min内检测出结果；检测的成本较低。缺点是：检测的精度较低，袁克等人的研究表明，其检测精度与酶联免疫法比较接近，低于高效液相色谱法。但这个缺点在收购现场的检测中是可以接受的。

综上所述，胶体金快速定量法具有明显的速度优势，较低的检测成本，可以接受的检测精度，比较适合收购现场对呕吐毒素的快速检测。

艾兰虹的研究表明，控制小麦赤霉病含量≤3%，可确保小麦呕吐毒素含量符合国家粮食卫生指标规定。在收购过程中，粮库可结合实际检测结果对赤霉病含量确定一个限量，对赤霉病超过限量的小麦，在现场用胶体金快速定量法检测呕吐毒素含量，检测合格的小麦方可入库，而检测不合格的小麦，则作为饲料粮另外存放或由售粮人自行处理，保证入库小麦呕吐毒素含量不超标。除收购过程中把好关，每天收购结束对仓房内小麦应抽取综合样，在有条件的情况下用高效液相色谱法准确测定呕吐毒素含量，也可用酶联免疫法或胶体金快速定量法进行检测。及时了解仓房内整个小麦呕吐毒素含量，并根据检测结果在接下来的收购过程中及时调整呕吐毒素的控制量。在整仓收购完成后，可用高效液相色谱法准确测定呕吐毒素含量，作为以后相关验收及销售的凭证。

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TS211.2，TS211.7

B

1674-5280（2016）04-0027-03

2016-06-02

徐存宽（1981—），男，本科，工程师，主要从事粮油检测工作。