TRAPPC9基因对奶牛金葡菌乳房炎抗性性状的遗传效应

冯　文，董易春，王　晓，刘　超，王　新，王雅春，俞　英*

(1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193； 2.西北农林科技大学食品学院，杨凌 712100)



TRAPPC9基因对奶牛金葡菌乳房炎抗性性状的遗传效应

冯文1，董易春1，王晓1，刘超1，王新2，王雅春1，俞英1*

(1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193； 2.西北农林科技大学食品学院，杨凌 712100)

摘要：旨在分析奶牛金黄色葡萄球菌(金葡菌)抗性候选基因TRAPPC9 的遗传效应。本研究利用中国北方地区6个牛场517头具有完整DHI、年龄及胎次记录的中国荷斯坦牛的生产数据，使用Multiplex SnaPshot微测序技术分析TRAPPC9基因4个SNPs的基因型，利用特异性PCR技术检测牛只感染金葡菌情况，同时测定血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17、NF-κB等细胞因子的含量。在此基础上，利用GLM模型最小二乘法分析TRAPPC9基因4个SNPs对奶牛金葡菌乳房炎抗性的遗传效应。结果表明：IL-17、TNF-α和IFN-γ可作为有效的乳房炎参考指标。对于金葡菌阴性牛，TRAPPC9基因SNP4(C2477531T)对SCS有极显著影响(P<0.01)；对于金葡菌阳性牛，该SNP对IL-17有极显著效应(P<0.01)。TRAPPC9基因可作为中国荷斯坦牛金葡菌乳房炎抗性分子标记之一。

关键词：奶牛；金黄色葡萄球菌；乳房炎抗性；TRAPPC9；细胞因子

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus，简称金葡菌)是感染奶牛乳腺最常见的病原菌之一[1]。金葡菌产生的毒素破坏宿主细胞膜，当毒素转移到乳腺导管系统，则毁坏泌乳细胞及乳房组织。此外，金葡菌可在宿主体内形成生物膜且多具有耐药基因，极易对抗生素产生耐药性[2-3]。金葡菌通常引起隐性乳房炎，难以发现、不易根治，对奶牛群乳房健康有严重影响，不仅导致奶牛产奶量和奶品质显著降低[4]，而且还影响奶牛正常生理功能并延长产后发情时间，严重时会造成奶牛过早淘汰，增加牛群更替成本。任改仙等在2008-2009年调查了北京地区奶牛场的乳房炎发病情况，发现金葡菌引起的隐性乳房炎和临床乳房炎发病比例分别为37.8%和33.3%[5]。可见金葡菌对奶牛乳房炎的发生具有不容忽视的影响。

转运蛋白颗粒复合体9基因(Trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)位于奶牛第14号染色体，全长387 232 bp。TRAPPC9基因编码的蛋白也叫NIBP(NIK and IKKβ-binding protein)，在胸腺、脾和外周血白细胞等免疫组织中表达，具有激活NF-κB信号过程的作用[6]。NF-κB在这些组织中起到非常重要的免疫调控作用[7]，其首先由R.Sen 和D.Baltimore 于1986 年发现并提出，后来的研究发现它在机体细胞的炎症反应和免疫应答中发挥着重要作用[8]。

本课题组前期基于北京地区中国荷斯坦牛乳房炎易感性及抗性进行全基因组关联分析发现，在TRAPPC9基因上存在显著影响乳房炎抗性的SNP[9]，且在乳肉兼用型三河牛群体中得到验证[10]。从DNA、mRNA和DNA甲基化3个水平以及蛋白质水平也发现，TRAPPC9基因可能通过DNA甲基化来影响中国荷斯坦牛乳房炎抗性[11]。

鉴于TRAPPC9基因对金葡菌乳房炎抗性的效应尚未见相关报道，本试验将其作为奶牛金葡菌乳房炎抗性的潜在候选基因，拟研究并分析TRAPPC9的4个SNPs对奶牛金葡菌乳房炎抗性的遗传效应，探讨TRAPPC9作为奶牛金葡菌乳房炎抗性候选基因的可能性，为金葡菌乳房炎抗性相关基因的分子遗传机制研究提供试验数据和理论基础。

1材料与方法

1.1数据来源

本研究以517头中国荷斯坦牛为试验动物。试验牛分别来自于饲养管理水平相对一致的北方6个规模化牛场，所用数据包括DHI(乳成分及体细胞数，测定采用的仪器是乳成分体细胞测定仪(YQ1-35))、年龄及胎次等生产数据。A、B、C、D、E、F 6个牛场的荷斯坦牛采样数目分别为131、29、143、91、59和64头。

1.2试验方法

1.2.1奶牛金葡菌感染情况的分子鉴定挑取Baired-Parker培养基上检测出的奶牛乳汁中的金葡菌阳性菌，提取DNA作为扩增模板，用Nuc(Thermostable nuclease，热稳定核酸酶)基因的特异性引物进行特异性PCR分子检测，排除假阳性菌株。将2次PCR均是阳性结果的扩增产物分别取20～30 μL进行测序验证。517头中国荷斯坦牛中，有44头牛乳汁中纯化鉴定出金葡菌，金葡菌感染牛比例为8.5%。每个牛场的金葡菌鉴定结果如表1所示。

表1采样牛群金葡菌感染情况

Table 1The status ofS.aureusinfection in each cattle population

1.2.2血样采集及血清指标测定方法从奶牛尾部静脉采集非抗凝血和抗凝血样各9 mL，非抗凝血用于血清分离和DNA提取，抗凝血用于RNA提取。新鲜抗凝血立即以1∶3的比例与裂解液(TRpure LS Reagent)剧烈震荡混合，然后分装到无RNA酶离心管中，-80 ℃保存。非抗凝血在常温下静置2～3 h后，3 000 r·min-1离心10 min，上层清亮黄色的液体为血清。分离的血清立即送往北京华英生物技术研究所进行相关指标的测定，下层暗红色血凝块用于DNA提取。

采用放免试剂盒检测血清中的细胞因子，包括白介素17(IL17)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、核转录因子κB(NF-κB)。

1.2.3SNP分型采用ABI 公司的Multiplex SnaPshot微测序技术对牛TRAPPC9基因(BTA14)进行SNP分型。引物设计、合成及分型均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。本研究所用到的TRAPPC9的4个SNPs信息如表2所示。

表2牛TRAPPC9基因SNPs信息

Table 2The information of SNPs of bovineTRAPPC9

1.2.4 荷斯坦牛TRAPPC9基因表达量的测定本研究利用百泰克血液总RNA提取试剂盒提取血样中的RNA，用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript®Reverse Transcription试剂盒进行反转录试验，利用SYBR Green染料实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法来检验候选基因TRAPPC9的表达量。

利用相对定量分析法[12]对候选基因TRAPPC9表达量进行分析，计算公式：ΔΔCt=[(Ct_target-Ct_control)]Sample A-[(Ct_target-Ct_control)]Sample B。Ct_target为目的基因的表达量，Ct_control为参考基因的表达量。Sample A为待测样本，Sample B为参照样本。本研究中用于分析候选基因表达量的参考基因是GAPDH。

1.3数据分析

1.3.1性状的描述性统计及相关分析使用Excel2010对中国荷斯坦牛SCC、SCS以及血清细胞因子进行描述性统计，包括有效记录数、平均值、标准差、最大值和最小值。并利用SAS9.1对以上性状进行相关分析。

1.3.2基因表达量分析选取E和F牛场部分荷斯坦牛，分析其不同乳房健康状态和有无金葡菌状况下TRAPPC9基因mRNA的表达差异。采用Excel2010进行t-test分析。首先，按照体细胞数及临床症状将奶牛乳房健康状态分为3个组，健康牛：SCC≤20万个·mL-1(n=19)；隐性乳房炎牛：20万

其中，y为测定日SCS或血清细胞因子性状的观察值(SCS由SCC转化而得，依据公式SCS=log2(SCC/100 000)+3)；μ为测定日SCS或血清细胞因子性状的总体平均值；g为基因效应；S为是否被金葡菌感染(Y感染，N未感染)；h为场效应，共有1、2、3、4、5、6个场；p为胎次效应，将1胎次划为一个胎次，2胎次及以上划为另一个胎次(奶业年鉴平均为2.5胎次)。g*S表示不同基因型与有无金葡菌感染的互作；e为随机残差。

考虑到金葡菌对体细胞数影响的不确定性，因此将金葡菌阴性牛和阳性牛分成两类，进一步研究SNPs对SCS及各类血清细胞因子的效应。

模型：y=μ+g+h+p+e

参数描述同上。

2结果

2.1 奶牛性状的描述性统计

对中国荷斯坦牛试验群体的乳汁体细胞数(SCC)、体细胞评分(SCS)和血清细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17和NF-κB数据进行初步的统计分析，基本统计量见表3。

表3性状的描述性统计

Table 3Descriptive statistics of traits in this study

2.2奶牛性状间的相关分析

对所有采样牛的SCS和血清IFN-γ、TNF-α、IL-17、 NF-κB含量进行相关分析，结果见表4。SCS与细胞因子IL-17之间呈极显著正相关(P<0.01)，与TNF-α之间呈显著正相关(P<0.05)，与IFN-γ呈极显著的负相关(P<0.01)；IL-17与NF-κB呈极显著正相关(P< 0.01)；细胞因子TNF-α和IFN-γ、NF-κB分别呈极显著负相关和极显著正相关(P<0.01)；IFN-γ与NF-κB呈极显著负相关(P<0.01)。

表4性状间的相关性

Table 4Correlations among traits

*.P<0.05；**.P<0.01。下同

*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below

针对金葡菌阳性牛，IL-17 与NF-κB呈极显著的正相关(r=0.567，P< 0.01)，与其他性状无显著相关。

2.3金葡菌对SCS和细胞因子的效应分析

为分析金葡球菌对SCS和细胞因子的效应，表5对金葡菌感染阳性牛和阴性牛中体细胞评分和细胞因子进行了单因素方差分析，可以看出金葡菌阴性牛的细胞因子的含量大于阳性牛的含量，且检验出金葡菌对SCS、IL-17和IFN-γ的水平有显著影响，阴性牛比阳性牛分别高1.30、2.02 pg·μL-1和4.43 pg·μL-1(P< 0.05)。

2.4奶牛不同乳房健康状态下TRAPPC9基因mRNA的表达水平

图1A为不同乳房健康状态下荷斯坦牛TRAPPC9基因的表达量，健康牛该基因的表达量极显著地高于临床乳房炎牛的表达量(P<0.01)；图1B为金葡菌阳性牛和阴性牛TRAPPC9基因的表达量，可以看出，阳性牛该基因表达量极显著地低于阴性牛(P<0.01)。

表5金葡菌阳性牛和阴性牛的SCS和血清细胞因子的比较

Table 5The comparison of SCS and serum cytokines betweenS.aureuspositive and negative cows

2.5TRAPPC9的SNPs对SCS和细胞因子的遗传效应

通过计算得知，金葡菌与TRAPPC9基因SNPs的互作对各个性状无显著影响，为了排除金葡菌的干扰，将金葡菌感染阴性牛和阳性牛分成两组，分别研究TRAPPC9的SNPs对SCS和血清中细胞因子的效应(表6)。

从表6可以看出，在未分离出金葡菌的荷斯坦牛中(金葡菌阴性牛)，SNP4对SCS影响显著(P<0.01)，TT基因型个体SCS显著高于CC和CT基因型个体；在分离出金葡菌的荷斯坦牛中(金葡菌阳性牛)，SNP4对细胞因子IL-17有极显著的影响(P<0.01)，TT基因型个体的IL-17含量分别比CC和CT基因型个体高5.17 pg·μL-1和4.79 pg·μL-1。

结果表明，在未感染金葡菌牛群中，SNP4的TT基因型可作为高SCS的分子标记；但是当奶牛感染金葡菌以后，SCS效果不显著，建议参考血清细胞因子IL-17的含量对金葡菌乳房炎奶牛进行初步判断。

3讨论

3.1金葡菌乳房炎牛与SCS及细胞因子的关系

奶牛乳汁中的体细胞数(SCC)及其对数转换值SCS一直被作为衡量奶牛乳房炎最重要的指标。但是实际生产发现SCC变化较大，且金葡菌感染牛的体细胞数不一定增多，只有约60%的金葡菌感染牛的SCC较高，而其余40%的金葡菌感染牛每毫升SCC低于200 000 个，因此不能准确地断定高低SCC与金葡菌感染之间的关系[13]。本试验发现，奶牛有无感染金葡菌对SCS有显著影响，且阴性牛的SCS高于阳性牛。因此当奶牛乳腺感染了金葡菌后，只能说明SCC会产生变化，但不能确定是升高还是降低，即只通过SCC很难准确判断奶牛是否患有金葡菌型乳房炎。X.Wang等在2014年发现，不同奶牛场的金葡菌菌株有不同的凝胶电泳图谱[14]，说明不同牛场之间金葡菌的变化大，引起产奶性状变化也不同。由于SCS与细胞因子以及细胞因子之间存在显著的相关关系(表4)，且血清细胞因子能够比较准确地判断奶牛乳房炎的炎症状况，因此建议通过一个或者多个指标综合判断奶牛的乳房炎状况，及时发现乳房炎患病个体。

3.2金葡菌感染阳性牛及阴性牛TRAPPC9基因SNPs对血清细胞因子的效应

因金葡菌对奶牛SCS有显著影响但又具有不确定性，为了排除金葡菌干扰，本研究将金葡菌阴性牛和阳性牛分成两类，用来研究TRAPPC9基因SNPs对SCS和血清细胞因子的效应。当奶牛未感染金葡菌时，SCS对乳房炎有很好的指示作用；但是当奶牛感染金葡菌以后，SNP4对SCS的效应不显著，而对IL-17有极显著性效应。因此应综合TRAPPC9基因SNP4的TT基因型对SCS和IL-17的效应来判断奶牛是否患有金葡菌乳房炎(表6)。

金葡菌感染奶牛乳腺后，会刺激炎症介质的产生，促使免疫细胞(主要是中性粒细胞)从血液转移到乳腺[15]。白介素17(IL-17)是一种促炎细胞因子，主要由CD4+T细胞亚群接受抗原刺激活化后分泌。IL-17A和IL-17F是Th-17细胞分泌的IL-17细胞因子家族中负责致炎作用的成员[16]，主要作用于造血细胞、成纤维等细胞，并诱导TNF-α等炎性细胞因子的分泌，进而清除病原微生物[17]。本试验发现，金葡菌阳性牛和阴性牛间的IL-17和IFN-γ含量有显著差异，阳性牛的两个细胞因子含量均低于阴性牛(表5)，这与冯士彬等人的报道相反[18]。出现金葡菌阳性牛细胞因子含量低于阴性牛的原因可能有两方面，一是当奶牛的乳房感染金葡菌以后发生局部炎症，血清中的细胞因子透过血管进入乳腺[19]，二是金葡菌可以逃脱中性粒细胞和巨噬细胞的免疫应答，并感染和抑制非专职吞噬细胞[20]，导致血清中的细胞因子含量降低。

表6中国荷斯坦牛TRAPPC9 的SNPs与SCS和细胞因子的关联分析(最小二乘均值±标准误)

Table 6Association analysis of SCS and serum cytokines with SNPs ofTRAPPC9 in Chinese Holsteins (LSM±SE)

3.3TRAPPC9基因与奶牛金葡菌乳房炎抗性

当奶牛乳房被金葡菌等病原微生物感染后，乳腺中的粒性白细胞会增多，粒性白细胞的聚集和激活需要大量的炎症因子[21]，炎症因子的增加会激活NF-κB通路，增加NF-κB的表达量。NF-κB在奶牛乳房炎中发挥重要作用，而TRAPPC9又对NF-κB信号通路起一定的调控作用。本研究发现，在感染了金葡菌的荷斯坦牛中，TRAPPC9(C2477531T)位点对IL-17的效应极显著(P<0.01)。IL-17与NF-κB存在极显著相关，这说明TRAPPC9可能通过影响IL-17，进而有效的增强NF-κB的活化能力，并最终影响奶牛对金葡菌乳房炎的抗性。

4结论

综上，本研究对荷斯坦金葡菌感染阳性牛和阴性牛的SCS和细胞因子水平进行了比较，发现金葡菌阴性牛的SCS和细胞因子的含量均高于阳性牛，说明感染金葡菌会引起细胞因子含量和SCS水平的变化。对荷斯坦牛金葡菌阴性牛和阳性牛TRAPPC9基因的SNPs与SCS及血清细胞因子进行关联分析，获得了效应显著的SNP4，验证了TRAPPC9基因作为中国荷斯坦牛金葡菌乳房炎抗性分子标记的可能性。

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(编辑郭云雁)

The Genetic Effect ofTRAPPC9 on Mastitis Resistance toS.aureusin Dairy Cows

FENG Wen1，DONG Yi-chun1，WANG Xiao1，LIU Chao1，WANG Xin2，WANG Ya-chun1，YU Ying1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.CollegeofFoodSciencesandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Key words:dairy cattle；Staphylococcusaureus；mastitis resistance；TRAPPC9；cytokine

Abstract:The present study was designed to investigate the genetic effect ofTRAPPC9 gene on resistance toStaphylococcusaureus(S.aureus) in Chinese Holstein cattle.A total of 517 Chinese Holstein cows with intact data of DHI，age and parity were collected from 6 farms of North China.Multiplex SnaPshot was used to analyze the genotype of 4 SNPs ofTRAPPC9 gene，the specific PCR was used to detectS.aureusinfecting cattle.Meanwhile，the contents of IFN-γ，IL-17，NF-κB and TNF-α in serum for each cattle were measured.Based on this，the genetic effects of the 4 SNPs inTRAPPC9 on mastitis resistance toS.aureuswere analyzed by the least squares method of GLM model.The results indicated that IL-17，TNF-α and IFN-γ could be used as effective indicators for mastitis.With regard to theS.aureusnegative Chinese Holstein cows，SNP4 (C2477531T) ofTRAPPC9 had highly significant effect on SCS (P<0.01)，while the SNP showed a highly significant effect on IL-17 inS.aureuspositive cows (P<0.01).These data imply that bovineTRAPPC9 gene could be a powerful molecular marker of mastitis resistance toS.aureusin Chinese Holsteins.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.009

收稿日期：2015-03-04

基金项目：国家自然科学基金(31272420)；农业部奶业体系项目(CARS-37-04B)；十二五国家科技支撑项目(2011BAD28B02)；教育部基本科研项目(2011JS006)；长江学者与创新团队发展计划(IRT1191)

作者简介：冯文(1992-)，女，陕西人，硕士生，主要从事动物分子数量遗传学研究，E-mail：wfeng@cau.edu.cn *通信作者：俞英，副教授，博士生导师，主要从事动物健康性状遗传改良及表观遗传调控研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

中图分类号：S823；S813.3

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0276-08