牛结核病疫苗研究进展

杜凤林，张秀玲

（1.吉林省镇赉县畜牧业管理局，吉林 镇赉 137303；2.镇赉县东屏镇畜牧兽医站，吉林 镇赉 137303）

牛结核病疫苗研究进展

杜凤林1，张秀玲2

（1.吉林省镇赉县畜牧业管理局，吉林 镇赉 137303；2.镇赉县东屏镇畜牧兽医站，吉林 镇赉 137303）

牛结核病是一种严重威胁到人类的经济安全和食品健康安全的主要人兽共患病传染病，其病原菌牛结核分支杆菌宿主范围广，易感动物为牛，其次是人、禽类和野生动物等。牛结核病病灶的位置与其感染途径有关，当牛结核分枝杆菌通过气溶胶的形式，经过被感染动物的呼吸道系统进入体内，依次感染动物的鼻粘膜、口腔黏膜、肺以及与呼吸系统相关的组织器官。然而当牛结核分枝杆菌通过饲草或者饮水感染牛时，结核病灶一般会出现在牛的肠系淋巴结中。牛结核病病理变化是在病变组织上出现粟粒性结核结节，呈现灰色或米白色颗粒状干酪样坏死组织且相互之间没有明显的界限。随着分子生物学及基因工程技术的发展，预防牛结核病疫苗的种类日新月异，本文将对牛结核病疫苗做一个整体概述。

1　卡介苗（BCG）

卡介苗是目前唯一一个被广泛认可的传统的预防结核病疫苗，它来源于减毒的结核分枝杆菌，最初通过在甘油-土豆培养基反复连续传代200多次，最终使其在免疫原性存在的基础上使其毒力减弱，致病性消失。该疫苗目前为止是预防牛结核病最权威的疫苗，为世界上牛结核病及人结核病的预防做出了巨大的贡献。但是该疫苗也存在一定的局限性，具体表现为年龄依赖性，即对新生牛的免疫效率能够达到80%以上，而对成年牛或动物的免疫效率只有50%左右。同时，BCG接种的牛在对其利用牛结核菌素（PPD）进行皮试反应检测结核病时，不能够区分出是自然感染牛还是BCG接种牛，从而严重干扰牛结核病阳性结果的判定，为牛结核病的检测造成困难。因此，迫切需要更加安全有效的新型预防牛结核病疫苗的研发及应用。

2　重组卡介苗

rBCG30是第一代重组卡介苗，是将pMBT30质粒重组到了卡介苗当中，从而过表达30-kDA Ag85B蛋白，在动物实验中 rBCG30表现出比BCG更好的保护作用，能够引起更高水平的免疫应答。在Ⅰ期临床实验中用结核菌素作为对照组，rBCG30同样也表现出良好的免疫原性。在安全性方面的实验中，rBCG30与BCG的试验结果大致相同。第二代重组BCG疫苗是VPM1002，这种疫苗是基于对结核杆菌的两次基因修复。将编码李斯特菌溶胞素（Hly）的基因整合到BCG基因组中，Hly可以在巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后形成的吞噬体内形成空隙以便结核菌素进入到细胞质中。与BCG相比，VPM1002可以进入到吞噬体内进而可以参与到主要组织相容性复合体（MHCⅡ）通路中。然而该重组BCG疫苗也有一定的缺陷，虽然利用基因工程技术使该重组BCG疫苗大量表达Ag85A、Ag85B和Rv3407三种蛋白并产生产气荚膜梭菌溶素，与Hly类似可以穿透巨噬细胞的细胞膜让BCG可以进入细胞质中，而且也在动物实验中得到良好的实验结果，但是在Ⅰ期临床实验中由于其安全性的原因并没有被应用于医疗领域。

3　减毒结核分枝杆菌疫苗

减毒结核分枝杆菌菌株又被称为是减毒活疫苗，在保留牛结核分枝杆菌免疫活性的基础上，利用基因工程技术将牛结核分枝杆菌基因组中的致病基因进行敲除或者突变，从而使牛结核分枝杆菌侵染宿主细胞所必须的蛋白质得不到表达，也就降低了其感染活性，削弱了其致病性。BCG本质上就是一种减毒活疫苗，但是由于BCG长时间的传代导致其基因组中的一些与免疫活性有关的基因丢失，从而降低了其免疫原性。人结核病的减毒活疫苗MTBVAC01已经到了Ⅰ期临床试验阶段，也是唯一一个应用于Ⅰ期临床实验的一株减毒结核分枝杆菌活疫苗。

在牛结核分枝杆菌活疫苗的研究中，现阶段最理想的方案是在找到并敲除牛结核分枝杆菌基因组中的两个与菌株毒力有关的区域，从而可以避免弱毒菌株在动物体内的毒力得以恢复。有研究通过化学突变的方法已经得到了两个牛结核分枝杆菌弱菌株而且在豚鼠和牛的试验中表现出低毒性的效果。营养缺陷型的牛结核分枝杆菌由于突变导致其自身不能合成参与其自身代谢的必需氨基酸，从而存活时间较短，对机体的毒力明显减弱，因此可以作为牛结核病弱毒疫苗。但是上述弱毒菌株的免疫原性与BCG效果相当，对免疫动物的保护作用并不是非常突出，因此还需要研究免疫效果表现良好且无毒力的弱毒牛结核分枝杆菌疫苗。

4　亚单位疫苗

牛结核病亚单位疫苗主要是利用原核或真核表达载体，使对牛结核分枝杆菌具有免疫原性的蛋白质在诱导剂的作用下能够在体外或体内大量表达。在牛结核分支杆菌分泌的ESAT-6蛋白基础上研发的亚单位疫苗能够增强试验动物对牛结核分枝杆菌免疫原性。除此之外，能够作为亚单位疫苗的候选分泌蛋白主要有Ag85A、Ag85B、MPT-64、MPT-32、HSP-76、HSP-70等，这些蛋白一直是被作为预防牛结核病亚单位疫苗研究的重点，其中Ag85B和ESAT-6亚单位疫苗已经进入到Ⅰ期临床试验阶段。亚单位疫苗的主要优点是针对性强，没有其他杂蛋白的干扰，对机体的副作用小。在表达目的蛋白的基因上加上组氨酸标签有利用目的蛋白的纯化和大规模制备，有利于工业化生产。与卡介苗最大的区别是，亚单位疫苗并不会干扰PPD的皮试结果，且不会出现毒力恢复的现象进而能够保障机体的安全性。此类疫苗的不足之处是其免疫效果并不如BCG和牛结核分枝杆菌减毒活疫苗理想，对免疫动物需要进行多次加强免疫从而增加了免疫程序和成本。由于亚单位疫苗在动物体内主要引起的免疫反应属于体液免疫，而牛结核分枝杆菌却是典型的细胞内寄生，因此这类疫苗并不是预防牛结核病最为理想的候选疫苗。

5　DNA疫苗

DNA疫苗指的是利用含有表达具有牛结核病免疫原性的蛋白质基因的质粒，来免疫实验动物刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。与亚单位疫苗相比该疫苗的制备过程相对比较简单快捷，且在免疫动物体内的表达时间较长，能够为免疫动物提供长时间的免疫保护作用。用做该疫苗免疫原的蛋白质主要有ESAT-6、CFP-10（Culture filtrate protein-10）、MPT64、MPT83、热休克蛋白Hsp-65等。核酸疫苗最大的缺点是单独使用对机体的免疫保护效果不佳，与完全佐剂或者免疫刺激因子CD86、CD80混合使用可以提高对机体的免疫作用。在细胞免疫水平上，其免疫效果略微强于亚单位疫苗的作用，但是与BCG疫苗相比还是有待提高。

6　重组活病毒载体疫苗

此类疫苗是将常见的病毒利用基因工程手段将其基因组中的毒力基因进行敲除或者敲除负责病毒DNA复制的基因，在保证安全的基础上得到能够插入大量外源基因的复制缺陷型病毒表达载体。常见的病毒载体主要有经过基因工程改造的痘病毒、禽痘病毒、腺相关病毒和腺病毒等。有研究用BCG对实验动物初免，再用含有Ag85A的重组腺相关病毒对其进行加强免疫，取得了比较好的免疫效果。MVA85A是安卡拉牛痘病毒经过改良后能够表达结核分枝杆菌Ag85A免疫蛋白的重组病毒，也可以用来对BCG免疫刺激以后的动物或者人类进行加强免疫。一些临床试验表明MVA85A作为疫苗对免疫个体足够安全且免疫时间持续较长。但是对该疫苗的免疫效果却一直存在着很大的争论，有人将BCG和MVA85A重组病毒疫苗混合免疫动物比BCG免疫动物所得到的免疫效果要明显很多。然而在非洲地区却不能得到同样的免疫效果，这可能意味着这类疫苗对生活在热带气候地区的人或动物比生活在温带气候的人或动物的免疫活性要低，这可能跟结核分枝杆菌的抗原暴露在较高的温度下情况有关。

7　结语

近年来随着对预防牛结核病疫苗研究的愈发深入，各类疫苗均有自身的不同的优缺点。但截至目前，从疫苗的免疫效果和对免疫动物的保护作用及疫苗的安全性而言，仍然没有任何一种疫苗能超越BCG。而现在很多新型结核病疫苗的研究也都是以BCG为基础，考虑的范畴也都是从降低BCG疫苗的副作用防治毒力返回、提高BCG疫苗的免疫原性并使其对机体的细胞免疫增强、与重组病毒疫苗采取异源初免-加强免疫的方式增强免疫和以BCG为基础研究的二连基因工程重组疫苗等，此类新型疫苗在动物实验中也都获得了较好的免疫效果，但是其安全性和有效性也在进一步的研究中。随着分子生物学和基因工程技术的发展以及研究人员对牛结核分枝杆菌的致病机理的进一步了解，可以进一步的为牛结核病新型有效疫苗的的研究提供更多的理论依据，相信不久的将来从事牛结核病疫苗研究的科研工作者能够研究出更加高效、安全、实用的牛结核病疫苗。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.003