宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌毒力基因检测和耐药性分析

张金宝，马春芳，余　婷，李晓娜，魏小平，王桂琴*

(1.宁夏大学农学院，银川 750021； 2.宁夏医科大学药学院，银川 750004；3.吴忠市红寺堡区农牧和科技技术局，吴忠 751999)



宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌毒力基因检测和耐药性分析

张金宝1，马春芳2，余婷1，李晓娜1，魏小平3，王桂琴1*

(1.宁夏大学农学院，银川 750021； 2.宁夏医科大学药学院，银川 750004；3.吴忠市红寺堡区农牧和科技技术局，吴忠 751999)

摘要：为了解宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌耐药性及毒力基因、耐药基因的分布情况，采用K-B法测定从奶牛乳房炎病例分离的197株大肠杆菌对16种抗菌药物的敏感性，并采用PCR技术对大肠杆菌毒力基因及耐药基因进行检测。结果显示，大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高，达到54.69%，对多西环素、四环素和链霉素的耐药率在39%左右，而对头孢唑啉、头孢噻肟、多黏菌素、氟苯尼考和喹诺酮类药物则比较敏感，敏感率都在60%以上。基因检测结果显示，除sta、stx2e这2种毒力基因未被检测到，astA、escV、eaeA、sepA、hlyA5种毒力基因的检出率分别是20.30%、14.72%、8.12%、2.03%、1.02%。四环素类的2种耐药基因均被检测到，其中tetC的阳性率为24.87%。氟喹诺酮类的GyrA、GyrB、ParC三种耐药突变的检出率分别高达97.46%、98.98%、98.48%。宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌携带astA、eaeA、sepA、escV、hlyA等毒力基因和介导四环素类、氟喹诺酮类耐药的基因，对16种抗菌药物具有不同程度的耐药性，且存在多重耐药菌株。

关键词：大肠杆菌；毒力基因；耐药基因；耐药性

1885年，澳大利亚医学家Escherich首次发现了大肠埃希菌，又称大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)。最初一直当作是正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，部分学者才逐渐认识到一些特殊血清型的大肠埃希菌对人和动物有致病性，特别对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻、猪水肿病、败血症、新生儿脑膜炎及肾炎等[1]，还可引起畜禽生长发育迟缓，生产能力低下，甚至造成死亡，给养殖业带来了严重的经济损失。致病性大肠埃希菌是引起许多疾病的罪魁祸首，并可以通过食物、水源等方式传播，从而引发疫情[2-4]。

为了解宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌的耐药情况，本试验根据CLSI[6](美国临床实验室标准委员会)方法对宁夏地区奶牛乳房炎病例分离鉴定出的197株牛源大肠杆菌进行了药物敏感性测定。同时采用PCR技术对其毒力基因以及耐药基因进行检测，初步分析两者之间的相关性，以期得到宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌耐药性的规律，并指导临床合理用药。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌株质控菌株大肠杆菌ATCC25922购自中国药品生物制品检定所；试验用大肠杆菌分离自宁夏地区部分奶牛场采集的奶牛乳房炎乳样。

1.1.2主要试剂及抗菌药物药敏纸片科玛嘉大肠杆菌显色培养基购自CHRO Magar公司；Gelred染料购自Biotium公司；DNA marker 购自上海生工公司；2×Taq MasterMix酶购自北京康为世纪生物科技有限公司；BHI肉汤、LB肉汤、麦康凯琼脂等购自北京奥星博生物技术有限公司；氨苄西林(10 μg·片-1)、头孢唑啉(30 μg·片-1)、庆大霉素(10 μg·片-1)、环丙沙星(5 μg·片-1)、多西环素(30 μg·片-1)、卡那霉素(30 μg·片-1)、氧氟沙星(5 μg·片-1)、链霉素(10 μg·片-1)、头孢噻肟(30 μg·片-1)、四环素(30 μg·片-1)、阿米卡星(30 μg·片-1)、氟苯尼考(30 μg·片-1)、诺佛沙星(10 μg·片-1)、恩诺沙星(5 μg·片-1)、复方新诺明(30 μg·片-1)、多黏菌素(300 μg·片-1)购自Oxoid Limited。

1.1.3主要仪器设备立式压力蒸汽灭菌锅，购自上海申安医疗器械厂；恒温培养箱THZA，购自上海一恒科技有限公司； SW-CJ苏净安泰洁净工作台，购自苏净集团苏州安泰空气技术公司；电子天平，购自北京塞多利斯仪器有限公司；PCR反应仪和凝胶成像仪，购自Biotium-rad公司；DYY-6C型电泳仪，购自北京六一仪器厂。

1.2大肠杆菌的分离鉴定

1.2.1样品采集对奶牛进行乳房炎检测，采集隐性和临床型乳房炎奶样，按常规挤奶消毒后，每个乳头挤去前2～3把乳后，无菌取奶样5 mL左右，贴好标签，4 h内送实验室进行处理。

1.2.2分离纯化和初步鉴定将采集的乳样用灭菌的棉签涂于麦康凯培养基上，置于37 ℃培养16～24 h，挑取单个典型菌落涂片，革兰染色进行镜检，观察细菌形态及染色特性，进行初步鉴定。再将镜检后的疑似大肠杆菌的菌落划线接种于新鲜制备的科玛嘉大肠杆菌显色培养基平板上，37 ℃培养16～24 h后，观察其菌落形态特征，挑取蓝色的单个菌落于BHI肉汤中，置于培养箱中37 ℃培养16～24 h，保存备用。

1.2.3PCR鉴定大肠杆菌根据文献和GenBank已发表的序列，确定16S rDNA引物[5]。16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。PCR反应条件：预变性94 ℃5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32个循环；72 ℃延伸5 min。配制凝胶进行电泳并进行DNA凝胶回收，将回收产物送至上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。

1.3药敏试验

严格按照美国临床实验室标准委员会(CLSI)2012年推荐的抗微生物药物敏感性试验执行标准[6]进行药敏试验。

1.4毒力基因和耐药基因的检测

根据文献[7-13]和GenBank上已公布的序列，确定7种毒力基因和5种耐药基因的引物序列，见表1。

表1毒力基因和耐药基因的引物序列

Table 1Primer sequences of virulence genes and resistance genes

PCR反应体系为25 μL：上游(F)、下游(R)引物各0.5 μL；2×TaqMasterMix酶 12.5 μL；ddH2O 11 μL；细菌DNA模板0.5 μL。PCR产物进行电泳，将电泳凝胶回收后送至上海英潍捷基贸易有限公司测序。

2结果

2.1大肠杆菌初步鉴定

将采集的乳房炎奶样经过麦康凯培养基初步培养，再经科玛嘉大肠杆菌显色培养基筛选，可见边缘整齐，湿润光滑的蓝色菌落，初步分离鉴定出疑似大肠杆菌204株。

2.2大肠杆菌PCR鉴定

采用PCR技术对204株疑似大肠杆菌进行16S rDNA检测，电泳产物回收后进行测序，将全部测序结果进行比对后，确定大肠杆菌197株。

2.3药敏试验

197株大肠杆菌对临床常用的16种抗菌药物的耐药情况见表2，分离菌株对16种抗菌药物具有不同程度的耐药性。其中对氨苄西林耐药率最高，达到54.69%，其次，对多西环素(39.59%)、四环素(39.09%)和链霉素(38.58%)的耐药率也较高，而对头孢类、多黏菌素、氟苯尼考和喹诺酮类药物则比较敏感，敏感率都在60%以上。

2.4大肠杆菌临床分离株多重耐药情况

本次试验分离的197株奶牛乳房炎大肠杆菌多重耐药情况见图1，对所有抗菌药物都敏感的菌株有30株，仅对一种药物耐药的有51株。多重耐药中7耐、5耐和11耐的菌株较多，所有菌株最多对15种抗菌药物耐药。

2.5毒力基因和耐药基因的检测

在7种毒力基因中，有5种毒力基因扩增出相应大小的目的片段，分别是astA、escV、eaeA、sepA、hlyA，而sta、stx2e没有扩增出相应大小的目的片段；5种耐药基因tetB、tetC、GyrA、GyrB、ParC全部扩增出相应大小的目的片段。

2.6197株大肠杆菌毒力基因及耐药基因的测序比对

对197株宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌毒力基因及耐药基因进行了测序比对。结果(表3)显示，未检测到sta和stx2e这2种毒力基因，astA、escV、eaeA、sepA4种毒力基因的检出率分别是20.30%、14.72%、8.12%、2.03%，而毒力基因hlyA的检出率最低，为1.02%。耐药基因中，四环素类的2种耐药基因tetC、tetB阳性率分别为24.87%、7.61%；氟喹诺酮类的三种耐药基因GyrA、GyrB、ParC检出率都很高，分别为97.46%、98.98%、98.48%。

表2大肠杆菌药敏试验结果

Table 2The susceptibility test results ofEscherichiacoli

3讨论

3.1药敏试验结果显示，宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌普遍对氨苄西林、四环素、链霉素和庆大霉素等药物具有一定的耐药性，而对诺氟沙星、阿米卡星、环丙沙星、氟苯尼考等药物的耐药率较低，且存在多重耐药菌株。所以在临床用药要尽量避免使用氨苄西林、多西环素、四环素、新诺明和链霉素等药物。

3.2尹召华[14]研究结果显示，毒力基因hlyA的阳性分离率是6.5%。杨少华等[15]研究显示，从兔场分离到的171株大肠杆菌中，eaeA基因的检出率为72.7%，说明该基因是导致兔腹泻的主要病原。本研究中未检测出sta、stx2e，其余几种毒力基因检出率较低，astA、eaeA等基因在宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌中检出率相对较高。黄名钱[16]研究显示，对四环素耐药的10株菌株中，tetB基因的阳性检出率为20%，tetC基因的阳性检出率为90%。F.A.Neela等、刘维红[17-18]研究表明，四环素类药物一般较多使用的为四环素，这种药物的作用机制可能与耐药基因tetB、tetC有关。本研究中，四环素类的2种耐药基因均被检测到，其中tetC阳性率为14.72%；氟喹诺酮类的GyrA、GyrB、ParC三种耐药突变均被检测到，而且检出率都很高，达到97.46%、98.98%、98.48%。由此可以看出，宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌携带astA、eaeA、sepA、escV、hlyA等毒力基因和介导四环素类、氟喹诺酮类耐药的基因。

表3毒力基因及耐药基因检测结果及测序比对结果

Table 3The detection rate and sequencing positive strain ratio results of virulence gene and resistance gene

3.3作者对扩增的GyrA、GyrB、ParC基因的PCR产物进行测序，并进行序列比对分析。根据GenBank已发表的序列，进行GyrA基因比对，在比对序列的813个碱基中发现，第10位多了1个碱基G，第429、690、723位均为G→A，第555位G→C，第750、768、775位均为A→G。GyrB基因测序比对的857个碱基中发现，第460、736、787位T→C，第685、775位C→T，第769位A→G。ParC基因测序比对的909个碱基中发现，第903位多了一个碱基T。近几年，GyrA基因的第83、87位点是热点突变，83位丝氨酸突变为亮氨酸或色氨酸时，则是大肠杆菌对喹诺酮类药物表现高水平耐药的原因之一。刘晓强[19]研究表明大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药水平的高低和其靶基因突变数目有着密切的关系，单一的突变只能导致低水平的耐药，高水平的耐药需要多个位点的突变。此次试验只涉及到PCR产物测序分析其部分片段的基因突变、缺失等，其是否会影响到大肠杆菌对该类药物的耐药水平还有待进一步研究。

4结论

宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌携带astA、eaeA、sepA、escV、hlyA等毒力基因和介导四环素类、氟喹诺酮类耐药的基因，对16种抗菌药物具有不同程度的耐药性，且存在多重耐药菌株。

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(编辑白永平)

Detection of Virulence Genes and Antimicrobial Resistance Analysis ofEscherichiacoliIsolated from Dairy Cow Mastitis in Ningxia

ZHANG Jin-bao1，MA Chun-fang2，YU Ting1，LI Xiao-na1，WEI Xiao-ping3，WANG Gui-qin1*

(1.CollegeofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China；2.Collegeofpharmacy，NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China；3.TechnologyBureauofHongsipuAgriculturalandAnimalHusbandry，Wuzhong751999，China)

Key words:Escherichiacoli；virulence genes；resistance genes；antimicrobial resistance

Abstract:The objectives of this study were to investigate resistance，virulence genes and resistance genes ofEscherichiacoliisolated from dairy cow mastitis in Ningxia.The antimicrobial resistance of 197Escherichiacolifrom dairy cow mastitis cases to 16 drugs was determined by the methods of K-B and the virulence genes and resistance genes were detected by PCR.The results showed that the resistance rate of ampicillin was the highest and it achieved 54.69%.Furthermore，the resistance rates of doxycycline，tetracycline and streptomycin were about 39%.It was more sensitive to cephazolin，cefotaxime，polymyxin，florfenicol，quinolones，and the sensitive rates were above 60%.The results of genes detection showed that the detection rates of virulence genesastA，escV，eaeA，sepA，hlyAwere 20.30%，14.72%，8.12%，2.03% and 1.02% respectively.The virulence genesstaandstx2ewere not detected.Tetracycline resistant genes were detected and the detection rate oftetCwas 24.87%.The detection rate of fluoroquinolone resistance genesGyrA，GyrBandParCwere 97.46%，98.98% and 98.48%，respectively.Our study demonstratesEscherichiacoliisolates from dairy cow mastitis in Ningxia carrying virulence genesastA，eaeA，sepA，escV，hlyAand the genes mediate resistance to tetracyclines，fluoroquinolones，and those isolates have varying degrees of resistance 16 kinds of antibacterial drugs，and some isolates are multi-resistant strains.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.024

收稿日期：2015-06-08

基金项目：国家自然科学基金(31160519)

作者简介：张金宝(1990-)，男，回族，宁夏西吉人，硕士生，主要从事兽医药理学与毒理学研究，E-mail：hxzhjb@163.com *通信作者：王桂琴(1970-)，女，河北清苑人，教授，博士，主要从事兽医药理学与毒理学研究，E-mail：nxwgq@126.com

中图分类号：S852.612

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0177-06