水牛STAT1基因多态与产奶性状关联分析

邓廷贤，庞春英，朱　鹏，段安琴，陆杏蓉，杨炳壮，梁贤威

(中国农业科学院广西水牛研究所，农业部(广西)水牛遗传繁育重点实验室，南宁530001)



水牛STAT1基因多态与产奶性状关联分析

邓廷贤，庞春英*，朱鹏，段安琴，陆杏蓉，杨炳壮，梁贤威*

(中国农业科学院广西水牛研究所，农业部(广西)水牛遗传繁育重点实验室，南宁530001)

摘要：本研究旨在检测水牛STAT1基因的单核苷酸多态性(SNP)，探究中国水牛多态性位点的群体遗传特征，寻找与产奶性状相关的分子标记。采用PCR和测序法筛选水牛STAT1基因序列的SNPs，以357头水牛为研究对象，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)对群体进行了基因型检测，运用SAS(9.3)软件一般线性模型(GLM)对STAT1基因型与产奶性状的关联程度进行统计分析。结果表明，在水牛STAT1基因中检测出3个突变位点，分别位于5′UTR(g.68G>A)、外显子10(g.986 G>T)和3′UTR(g.2881 C>A)。关联分析结果显示，水牛STAT1基因g.986G>T位点与305天产奶量和乳脂率显著关联(P<0.05)。Bonferronit检验多重比较结果显示，基因型TT和GG个体的305天产奶量显著高于GT基因型(P<0.05)，基因型TT个体的乳脂率显著高于GG和GT基因型(P<0.05)，且305天的产奶量随着胎次的增加呈现上升趋势，直到第3或4胎次时达到最大值，表明胎次是影响水牛产奶量的重要环境因素之一。本研究表明，水牛STAT1基因的g.986G>T位点可能是影响其产奶性状的候选分子遗传标记，为今后建立中国水牛标记辅助选择育种研究奠定基础。

关键词：水牛；STAT1基因；产奶性状；飞行时间质谱；关联分析

信号转导和转录激活子(Signal transduction and activators of transcription，STATs) 蛋白家族由7个家族成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6 组成，是由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子，活化的STAT二聚体化后移位于细胞核，与特异性DNA 启动子结合直接参与调节基因的表达，在免疫调控、促进细胞生长、抗凋亡、促进细胞周期方面发挥重要作用[1-3]。其中，STAT1基因主要是通过参与生长激素[4]与催乳素[5]的信号转导影响哺乳动物的泌乳性能。水牛STAT1基因cDNA序列长3 437 bp，包含1个2 244 bp的开放阅读框，由25个外显子组成，共编码747个氨基酸[6]，与奶牛的STAT1基因结构类似[7]。基于STAT1基因的功能，众多研究已发现，STAT1基因在不同组织、不同生理阶段均表现出特性的表达[8]以及存在着大量的与产奶性状显著相关的数量性状基因座(Quantitative trait locus，QTL)[9-10]。显然，STAT1基因可作为哺乳动物产奶性状研究的候选基因。O.Cobanoglu等[11]报道了荷斯坦奶牛STATl基因3′-UTR的1个SNP，其中CC和CT基因型与高产奶量、高乳脂率、高乳蛋白率呈正相关。褚敏等[12]检测了STAT1基因的多态性与中国荷斯坦奶牛产奶性状的关联，结果发现在内含子11有2处突变，且为连锁突变；在 3′-UTR 发现1处突变；这些突变均影响奶牛的产奶性能。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术，简称飞行时间质谱，是近年来应用在生物大分子检测领域的一种新技术。飞行时间质谱的工作原理是通过调整不同SNP位点的引物，设计出一组分子质量不同的延伸产物，通过质谱测定确认每个位点的基因型，具有分型准确、灵敏高和高通量等优势，已经在家畜育种应用中展示出巨大的SNP分型潜力。初芹等[13]利用飞行时间质谱法针对122头奶牛59个SNPs标记位点进行了高信息量SNP筛选，证实了该技术选出的高信息量SNP标记是可行和可信的。

本研究以水牛为研究对象，采用飞行时间质谱法对STAT1基因进行多态性检测，并与其产奶性状进行关联分析，旨在从分子水平挖掘与水牛产奶性状相关的标记，为今后开展水牛标记辅助选择研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

357头水牛由广西水牛研究所种畜场统一饲养管理，营养以及管理水平保持一致，该群体包含2个纯种品种(摩拉水牛和尼里-拉菲水牛)以及4个杂交品种(摩拉×本地，尼里×本地，摩拉×尼里和摩拉×尼里×本地三品杂)。其中从广西水牛研究所种畜场收集了336头水牛表型数据均用于数据统计分析。每个个体采取耳静脉取血，每2 mL保存于真空采血管中(含肝素钠抗凝剂)，4 ℃保存。

1.2主要试剂

血液基因组DNA提取试剂盒购置于北京天根生物科技有限公司；PCR所用试剂的采购来自宝生物(大连)科技有限公司；PCR引物由宝生物(大连)科技有限公司合成。

1.3PCR扩增

参考GenBank数据库中水牛STAT1基因序列(登录号：KJ139981.1)，采用Primer 6.0软件设计引物，用于水牛STAT1基因的PCR扩增。以18头水牛DNA样本为模板进行PCR扩增，引物退火温度和片段长度见表1。PCR反应体系50 μL：含PremixTaq25 μL，基因组总DNA 1 μL，上下游引物混合物 2 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1～1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

表1STAT1基因SNP筛选引物序列

Table 1Primers sequence used to screen SNPs inSTAT1 gene

1.4SNP筛选

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，委托深圳华大基因生物科技公司测序。根据序列峰图和DNAStar软件比对分析，筛选SNPs位点。

1.5基因分型

根据测序结果，选择水牛STAT1基因初步筛选的3个突变位点(表2)，参照文献[14]的方法检测357头水牛个体中各突变位点的SNP分型。

表2水牛STAT1基因SNP位点筛选

Table 2SNP screening ofSTAT1 genes in buffalo

1.6统计分析

采用PowerMarkerV3.25软件[15]计算多态位点的等位基因频率、基因型频率、多态信息含量、群体杂合度，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用SAS(9.3)软件的GLM过程对产奶性状和STAT1基因型进行关联分析。关联分析模型为：Yijk=μ+Gi+Pj+Sk+eijk，其中，Yijk为产奶性状表型记录；μ为群体平均值；Gi为基因效应；Pj为胎次效应；Sk为季节效应；eijk为随机残差。

2结果

2.1水牛STAT1基因多态位点的筛选

以18头水牛基因组总DNA为模板对水牛STAT1基因部分序列进行PCR扩增，扩增产物经1% 的琼脂糖凝胶电泳检测和测序，结合DNAstar SeqMan软件比对后，发现水牛STAT1基因有3个突变位点，分别位于5′UTR(g.68G>A)、外显子10(g.986 G>T)和3′UTR(g.2881 C>A)区域。其中，g.986G>T为错义突变，可造成L280R氨基酸残基替换。

2.2基因分型

针对上述筛选的3个SNPs位点进行了水牛群体的SNP基因分型。由图1可以看出，所有的SNPs位点中均检测出有3种常见基因型，平均检测率达98.0%。 以图1 A为例，g.68G>A位点中野生型GG个体有180个，突变杂合子GA个体有142个，突变纯合子AA个体有28个，未检测出基因型的只有7个，表明MALDI-TOF-MS技术可以精确的检测出野生纯合子、突变纯合子以及突变杂合子等3种常见的基因型，且准确率很高，可用于后续分析。

2.3群体遗传分析

3个突变位点在357头测试群体的基因型频率、等位基因频率、杂合度和多态信息含量(PIC)等统计参数值见表3。由表3可知，g.68G>A位点的GG是优势基因型，G为优势等位基因，处于中度多态状态。而g.2881 C>A位点的CC是优势基因型，C为优势等位基因，处于低度多态状态。同时χ2检验表明，上述3个SNPs突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

2.4STAT1基因突变位点不同基因型对水牛产奶性状的影响

305天产奶量、乳蛋白率和乳脂率3个产奶性状的最小二乘均值及其与水牛STAT1基因突变位点不同基因型的关联分析结果见表4。由表4可以看出，水牛STAT1基因g.986G>T位点与305天产奶量和乳脂率的关联程度达到显著水平(P<0.05)，但与乳蛋白率差异不显著；Bonferronit检验多重比较分析结果显示，TT和GG基因型个体的305天产奶量显著高于GT型(P<0.05)，基因型TT个体的乳脂率则均高于GG和GT基因型个体，其差异显著(P<0.05)。对于g.986G>T位点而言，不同的胎次和水牛的305天产奶量关联程度在P<0.05水平上达到显著、与乳蛋白率及乳脂率关联不显著(P>0.05)。由表5可知，水牛305天的产奶量随着胎次增加呈现逐渐提高的趋势，直到第3和4胎次时达到最大值，表明胎次是影响水牛产奶量的重要因素之一。

表3水牛STAT1基因突变位点的基因型和等位基因频率及遗传多样性

Table 3Allele frequency，genotype frequency of SNPs in buffaloSTAT1 gene

表4STAT1突变位点不同基因型与水牛产奶性状的关联分析

Table 4Association analysis between SNPs ofSTAT1 gene and milk performance traits in buffalo

相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同The same letter indicated no significant difference，different letters indicated significant difference at the 0.05 level.The same as below

表5g.986G>T位点不同胎次与水牛产奶性状的相关性分析

Table 5Association of parities of g.986G>T with milk production traits in buffalo

3讨论

STAT家族蛋白是各种细胞因子、生长激素等信号转导的重要调解因子，它们通过调解这些因子启动胞内JAK/STAT信号传导，对胚胎的发育、器官发生和功能、细胞分化、生长和凋亡的调控等起着重要作用[9，16]。其中，STAT1、STAT3和STAT5等STAT家族基因可通过JAK/STAT信号途径影响哺乳动物的泌乳性能[17-18]，从而引起众多育种学家的关注。已有研究证实，STAT1[11-12]和STAT5a[19]基因对奶牛的产奶性能有显著影响，但有关水牛STAT1和STAT5a基因多态性与其产奶性能之间关系的研究报道甚少，仅T.Deng等[6]报道了STAT1基因的克隆与组织表达分析以及季敏等[20]报道了槟榔江水牛STAT5a基因遗传多态性分析，共发现了38个SNPs位点，其中4个SNPs位于外显子，34个SNPs位于内含子，4个外显子SNPs没有导致氨基酸的变化，属于同义突变。

本研究利用PCR测序法在水牛STAT1基因序列中筛查出3个突变位点，分别位于5′UTR(g.68G>A)、exon10(g.986 G>T)和3′UTR(g.2881 C>A)。其中g.68G>A和g.986 G>T位点的PIC含量分别为0.353 0和0.400 3，根据PIC大小与遗传多样性等级表明这2个位点均属于中度多态[21]。g.2881 C>A位点的PIC含量为0.220 4，属于低度多态。同时χ2检验表明，上述3个SNPs突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，表明这些位点在水牛培育过程中还未受到人工选择和选育影响。

本研究中，水牛STAT1基因g.986 G>T位点对其产奶量和乳脂率具有显著的影响作用(P<0.05)，且TT和GG基因型个体的305天产奶量显著高于GT型(P<0.05)，基因型TT个体的乳脂率则均高于GG和GT基因型个体，其差异显著(P<0.05)；TT基因型个体的乳蛋白率也高于GG和GT基因型，但差异不显著(P>0.05)。由表4可看出，水牛305天的产奶量与乳脂率呈正相关，F.M.Gil等[22]的研究结果类似，却与奶牛“产奶量与乳脂率为负相关”的观点相反[19，23]。在g.986 G>T位点，305天的产奶量随着胎次的增加呈现上升趋势，直到第3或4胎次时达到顶峰，推测胎次是影响水牛群体产奶量的重要环境因素。显然，对g.986 G>T位点而言，T等位基因对于提高水牛产奶性能具有一定的优势，且χ2检验表明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，推测所研究的水牛群体受人工选择或选育影响较小，在以后的选择过程中，应逐步考虑优势等位基因的固定，同时注意胎次的影响，以提高水牛产奶性能。但是由于本研究中的试验样本量较小，需要进一步在大群体中去验证，以鉴定该位点是否可以作为影响水牛产奶性能的有效分子标记，为今后开展水牛标记辅助选择育种研究奠定坚实的基础。

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(编辑郭云雁)

Association between Polymorphism ofSTAT1 Gene and Milk Production Traits in Buffalo (Bubalusbubalis)

DENG Ting-xian，PANG Chun-ying*，ZHU Peng，DUAN An-qin，LU Xing-rong，YANG Bing-zhuang，LIANG Xian-wei*

(KeyLaboratoryofBuffaloGenetics，BreedingandReproductionTechnology，MinistryofAgricultureandGuangxi，BuffaloResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Nanning530001，China)

Key words:buffalo；STAT1 gene；milk production traits；matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry；association analysis

Abstract:This study aimed to identify single nucleotide polymorphism (SNP) of the buffaloSTAT1 gene，investigate population genetics characters of SNPs and find molecular markers for milk production traits in Chinese buffaloes.The polymorphisms ofSTAT1 gene were detected by PCR and sequencing methods.Population genetic polymorphisms for 357 buffaloes were genotyped by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technology，and the associations analysis between genotypes and milk production traits was performed by the SAS (9.3) software with generalized linear model.The results showed that the total of 3 SNPs were detected on the 5′UTR，exon10 and 3′UTR inSTAT1 gene，namely g.68G>A，g.986 G>T and g.2881 C>A，respectively.Association analysis indicated that 305-day milk yield and fat percentage were significantly associated with the g.986 G>T ofSTAT1 gene (P<0.05).The results of Bonferronit-test revealed that 305-day milk yield of individuals with TT and GG genotypes were significantly higher than those with GT genotypes (P<0.05)，and fat percentage of individuals with TT genotype were significantly higher than those with GG and GT genotypes (P<0.05).And the 305-day milk yield tended to increase from first to later parities，reaching the maximum at the 3rd or 4th calving，indicating that parity was one of factors affecting the milk production of buffalo.Our findings in this study implied that the g.986 G>T ofSTAT1 gene might be a candidate molecular marker for milk production traits in buffalo，which provide a foundation for studying the marker-assisted selection programs in Chinese buffaloes.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.007

收稿日期：2015-01-19

基金项目：国家国际科技合作专项(2014DFA31970)；桂渔牧科(1304512)

作者简介：邓廷贤(1983-)，男，湖南郴州人，硕士，助理研究员，主要从事水牛分子遗传学研究，E-mail：dtx282000@163.com *通信作者：梁贤威，研究员，主要从事水牛繁殖与营养研究，E-mail：liangbri@126.com；庞春英，副研究员，主要从事水牛遗传育种研究，E-mail：pangcy800@163.com

中图分类号：S823.83;S813.3

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0048-07