基于表达谱芯片挖掘清远麻鸡和科宝肉鸡比目鱼肌差异表达基因

束婧婷，章　明，宋　迟，单艳菊，徐文娟，宋卫涛，李慧芳

(江苏省家禽科学研究所，扬州 225125)



基于表达谱芯片挖掘清远麻鸡和科宝肉鸡比目鱼肌差异表达基因

束婧婷#，章明#，宋迟，单艳菊，徐文娟，宋卫涛，李慧芳*

(江苏省家禽科学研究所，扬州 225125)

摘要：对生长速度长期的高压选择导致了快大型肉鸡与优质型地方鸡显著的表型差异，本研究旨在研究这种表型差异的分子遗传机理。采用Agilent鸡全基因组表达谱芯片对达到性成熟的优质型清远麻鸡(112 d)和快大型科宝肉鸡(42 d)比目鱼肌中与肌纤维发育和类型组成相关的候选基因及信号通路进行系统筛查。结果，芯片分析共筛选到差异倍数在2倍及以上的基因1 318个，以科宝肉鸡作为参照，清远麻鸡中上调基因501个，下调基因817个，主要涉及到肌肉发育、能量代谢、脂质代谢等生物学过程。基于KEGG Pathway分析发现，差异基因除了参与肌纤维发育和分化相关信号通路(如Hedgehog信号通路和Ca2+信号通路)外，Wnt信号通路，mTOR信号通路，MAPK信号通路，ErbB信号通路、JAK-STAT信号通路等一些跟能量代谢相关的信号通路也被富集为显著的信号通路。与能量代谢相关的信号通路和与肌肉发育相关的信号通路相互作用形成一个调控网络从而影响肌纤维的发育，筛选出了20个在肌纤维生长发育及分化过程中可能具有重要影响的候选基因，但这些差异表达基因在肌纤维的发育和分化过程中的作用尚待深入研究。

关键词：肌纤维性状；表达谱芯片；差异表达基因；清远麻鸡；科宝肉鸡

随着人们生活水平的不断提高和消费观念的转变，肉品质愈来愈受到人们的重视。我国是一个禽类品种资源十分丰富的国家，各地方鸡种多以肉质鲜美而著称，尤其是广东的清远麻鸡，素以皮色金黄、肉质嫩滑、皮脆爽、骨软、风味独特而驰名于粤港澳市场。本课题组前期研究发现，相较于快大型鸡而言，清远麻鸡肌肉具有较高的红肌纤维比例和肌纤维密度以及较细的肌纤维直径[1]；而科宝肉鸡是全球著名的快大型肉鸡品种之一，具有生长速度快、饲料转化率高、屠宰率高等优点，但肉质风味则较差。因此，这两个品种是研究鸡肌肉生长发育及肉品质遗传机理的理想动物模型。

肌肉是鸡胴体中最主要的组成部分，而肌纤维则是构成肌肉组织的基本单位，根据外观、收缩特性和代谢特征可将肌纤维分成慢肌纤维(Ⅰ型和Ⅱa型，色红，进行有氧代谢)和快肌纤维(Ⅱb型，色白，进行酵解代谢)[2]。不同部位的肌肉，其肌纤维组成和比例往往不同。如鸡的比目鱼肌主要由慢肌纤维组成，而趾长伸肌则主要由快肌纤维组成。研究表明，肌纤维类型是直接影响肌肉生长发育和肉品质的重要因素[3-4]。慢肌纤维多的肌肉品质相对较好，色红、纤维细、风味好，而快肌纤维多的肌肉肉色苍白、肉质较粗糙[5-6]。肌纤维的生长发育及类型的形成是受多基因影响和调控的复杂过程，在鸡中，对于影响和调控这一复杂过程的分子机制还缺乏系统的研究。

基因芯片技术能够同时检测出某个特定组织中的大量差异表达基因，目前已被广泛应用于生命科学研究等领域[7-8]。T.Wu等利用芯片技术研究发现，金华猪背最长肌中脂肪酸合成和抑制肌肉生成相关基因的上调表达可能是解释该品种肌肉中IMF含量较高的原因[8]。Y.Li等研究发现，梅山猪背最长肌中的差异表达基因主要集中在TGF-α，MAPK，Wnt，mTOR和insulin等信号通路[9]。然而，目前在全基因组水平上比较不同品种鸡肌肉中基因表达谱差异的报道较少，仅Q.Zheng等采用Affymetrix芯片对蛋鸡和肉鸡不同发育时期胸肌进行差异表达基因的筛选，发现了调控肌肉生长速度的一些关键基因[10]。本试验采用Agilent鸡全基因组表达谱芯片(4×44K，Design ID：026441)对肉质优良的地方鸡种-清远麻鸡(Qingyuan partridge chickens，QP)和快大型的科宝肉鸡(Cobb，CB)比目鱼肌中的差异表达基因和信号通路进行研究，探讨两品种间肌肉组织表达谱的差异及其可能的分子生物学内在联系与规律，以期为进一步研究调控肌纤维生长发育及肌纤维类型的分子机制提供理论依据，为优质鸡肉质性状的标记辅助选择和育种奠定基础。

1材料与方法

1.1试验动物

清远麻鸡和科宝肉鸡种蛋分别来自于广东天农食品有限公司清远麻鸡原种场和广东佛山新广农牧有限公司科宝肉鸡保种群。种蛋孵化后，在同样的环境和饲养条件下进行饲养，全程自由采食和饮水。饲养至每品种性成熟日龄(清远麻鸡，112 d，平均体重1 330 g；科宝肉鸡，42 d，平均体重2 825 g)时分别选取体重相近的10只母鸡进行采样，每只鸡采集两侧比目鱼肌，其中右侧比目鱼肌中间1 cm×1 cm部分用于肌纤维性状的测定，左侧相同部位样品用于RNA抽提，所有样品均置于液氮速冻，然后转入-80 ℃冰箱保存备用，随机选择3个个体用于芯片分析。

1.2肌纤维性状测定

在恒温冷冻切片机内进行冰冻切片的制作，每个样品在腓肠肌外侧头中间处垂直于肌纤维延展方向做10张连续横切切片，切片厚度12 μm。采用ATPase碱孵育法进行肌纤维类型、肌纤维密度、肌纤维直径和面积的判定，在经典的Guth-Samaha法[11]基础上改良后进行染色，全部试剂均新鲜配制。

1.3RNA提取、质量检测及纯化

采用mirVanaTMRNA提取试剂盒 (Applied Biosystem p/n AM1556)提取总RNA，用Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent)对总RNA进行质量检测，合格后使用QIAGEN RNeasy®Mini Kit(QIAGEN)和RNsae-Free DNase Set (QIAGEN)纯化总RNA。

1.4基因芯片杂交

基因表达谱芯片采用Agilent公司的鸡全基因组4×44K芯片(Design ID：026441)，探针数量为43 803。芯片杂交及数据处理由上海欧易生物医学科技有限公司完成。采用Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color试剂盒(Agilent)对总RNA进行放大和标记；总RNA经第一链和第二链合成得到cRNA，Cyanine-3-CTP(Cy3)标记cRNA链后，用QIAGEN RNeasy Mini kit(QIAGEN)纯化标记后的cRNA；芯片杂交采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒；采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，分辨率为5 μm，扫描仪自动以100%和10% PMT各扫描1次，以Agilent自动合并2次结果作为最终结果；用Feature Extraction Software (version10.7.1.1，Agilent Technologies)读取数据；用Genespring Software (version 12.5；Agilent Technologies)进行归一化处理，算法为Quantile。所有操作均按试剂盒说明和Agilent表达谱芯片试验操作和分析手册进行。

1.5芯片数据生物信息分析

1.5.1差异表达基因的筛选利用Genespring Software 12.5对清远麻鸡和科宝肉鸡比目鱼肌标准化的数据进行筛选，保留所有标志都为P(Present探针点有信号，且信号值可信)的探针，去除含有M(Marginal探针信号饱和或信号值可疑)和A(Absent探针点无信号)的探针；去除内部质控探针。差异基因的筛选标准为：以科宝肉鸡为对照，差异倍数在2倍及以上且P<0.05的基因。

1.5.2差异基因Gene Ontology功能注释基于Gene Ontology数据库(http：// www.geneontology.org/)，采用Molecule Annotation System (MAS 3.0，http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)对差异表达基因进行GO分类分析，得到基因参与的所有GO，利用Fisher精确检验和卡方检验计算每个GO的显著性水平，从而筛选出差异基因所体现的显著性GO，显著性筛选的标准为P<0.05。

1.5.3差异基因Pathway分析基于KEGG数据库(http：//www.genome.jp/kegg/)，利用Fisher精确检验和卡方检验对差异基因参与的Pathway进行显著性分析，按照P<0.05进行筛选，得到显著的Pathway。

1.6荧光定量PCR

为验证芯片的结果，本研究选择了11个差异表达基因，根据GenBank中的基因序列设计引物(引物序列见表1)。以清远麻鸡和科宝肉鸡比目鱼肌总RNA为模板，采用SYBR Green I法进行荧光实时定量PCR反应，以β-actin基因作为内参基因进行数据的标准化处理，反应体系：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL (10 μmol·L-1)，cDNA 模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 7.8 μL补足20 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共40 个循环，扩增后经熔解曲线检测特异性。每次反应均设空白样品为阴性对照，每个样品设置3个重复。相对定量的结果采用2-△△Ct法进行计算。采用Pearson’s相关检验对基因芯片和qRT-PCR 两种方法的结果进行相关性分析。

2结果

2.1清远麻鸡和科宝肉鸡比目鱼肌肌纤维性状比较

采用ATPase染色方法对两个品种鸡比目鱼肌的肌纤维横截面积、直径、密度、红肌纤维比例和白肌纤维比例等指标进行统计，结果如表2和图1所示。两品种鸡比目鱼肌在肌纤维横截面积、直径和密度上均表现出显著差异，科宝肉鸡的肌纤维横截面积和直径显著高于清远麻鸡(P<0.05)，而肌纤维密度则显著低于清远麻鸡(P<0.05)。清远麻鸡的红肌纤维比例同样要高于科宝肉鸡，但差异不显著(P>0.05)。研究结果进一步验证了两个品种在肉品质上存在差异。

表1荧光定量PCR引物

Table 1Primer sequences used for Q-PCR

表2两个品种鸡比目鱼肌肌纤维性状比较

Table 2Myofiber characteristics of the SOL muscles in the 2 chicken breeds

NS.P>0.05；*.P<0.05

2.2两个品种比目鱼肌中的差异表达基因

采用Agilent鸡全基因组表达谱芯片比较优质型的清远麻鸡和快大型的科宝肉鸡比目鱼肌基因表达谱差异，共发现差异倍数在2倍及以上的基因1 318个(P<0.05，FC≥2)，以科宝肉鸡作为参照，清远麻鸡中上调基因501个，下调基因817个。

较细的纤维直径和较高的红肌纤维比例可能是导致清远麻鸡肉质优良的关键因素，因此为了阐明基因表达模式差异与不同表型之间的关系，基于NCBI的OMIM数据库以及已发表的文献报道，找到了一些与肌纤维发育及类型组成相关的重要基因，详见表3。与科宝肉鸡相比，清远麻鸡比目鱼肌中PPARGC1B、PPARD、PRKAG1、HSPB1、MAPK6、GDF3、STAT5B以及PRKAG3基因的表达是上调的，而MYH1E、MYH1B、WNT11、IGF1、MYOG、MYO1A、PRKAR2B、FGF7、WNT2B、SCD5、FASN及WNT5A等基因的表达是下调的。

2.3差异表达基因的GO功能分类分析

采用MAS3.0软件对差异表达基因进行GO(GO ontology)功能分类，如图2所示。在生物学过程方面，共发现167个显著性GO，主要涉及到细胞过程、生理过程、生物学调控、生物学过程的调节、多细胞生物过程、发育学过程、应激反应、免疫系统加工过程、生物学过程的正调控和负调控等。

2.4差异表达基因的信号通路分析

对差异表达基因通过KEGG数据库进行信号通路分析，富集检测的P<0.05的与肌纤维发育及类型组成相关的信号通路总共有18条，包括MAPK信号通路，涉及的基因有EGFR、HSPB1和FGF7；钙离子信号通路(Calcium signaling pathway)，涉及的基因有PDGFRA、PDGFRB、PLCB1、NOS1和SLC8A3；Wnt信号通路，涉及的基因有SFRP2、WNT9A、WNT2B、FZD2、WNT8B、PPARD、LEF1、WNT11、WNT5A和VANGL2；Hedgehog信号通路，涉及的基因有BMP4、BMP5和PTCH1；TGF-beta信号通路，涉及的基因有BMP4、BMP5、SMAD1、FST和THBS4；ErbB信号通路，涉及的基因有PIK3R1、PIK3R3和STAT5B；Jak-STAT信号通路，涉及的基因有PIK3R1、PIK3R3和SPRED1；mTOR信号通路，涉及的基因有IGF1、PIK3R1、PIK3R3和PRKAA2；不饱和脂肪酸合成信号通路，涉及的基因有SCD5、FADS1和TECR；脂肪酸合成通路，涉及的基因为FASN；以及Notch信号通路，涉及基因为NOTCH2等。每个信号通路均只包含几个发生表达变化的基因，而每个表达变化的基因通常不局限于一个通路。

2.5差异表达基因的荧光定量PCR验证

为了验证基因芯片所筛选的差异表达基因，随机选取了11个基因，其中上调基因3个(PRKAG3、STAT5B和BMP4)，下调基因8个(MYH1E、EGFR、ADIPOQ、PIK3R3、FASN、NOTCH2、SCD5和WNT5A)，以β-actin为参照基因，采用荧光定量PCR的方法进行了验证。尽管芯片和荧光定量PCR两种方法所得到的差异倍数有所不同，但所选基因的表达趋势是一致的，通过相关分析发现，两种方法所得的结果具有正相关关系，Pearson相关系数为0.33～0.93(图3)，结果进一步验证了芯片结果的可靠性。

表3清远麻鸡与科宝肉鸡中筛选到的一些与肌纤维发育及类型组成相关的基因

Table 3List of representative genes related to myofiber characteristics in soleus muscle in Qingyuan Partridge chickens and Cobb broilers

3讨论

骨骼肌是由异源特异性的肌纤维组成，不同类型的肌纤维在形态、数目、收缩和代谢特性等方面差异较大，因而由不同类型的肌纤维组成的肌肉之间也存在较大差异，而肌纤维的类型组成与肌肉品质(肉色、嫩度、风味、多汁性)密切相关。本研究发现，清远麻鸡比目鱼肌的肌纤维密度显著高于科宝肉鸡，而肌纤维横截面积和直径却显著低于科宝肉鸡，这一结果进一步验证了E.Dransfield等的结果[12]，即禽类在出生后生长发育过程中，肌纤维数目多则生长缓慢，反之，肌纤维数目少则生长快速，同时也与肌纤维大小与肉品质呈负相关的观点相符[13]。清远麻鸡比目鱼肌中的红肌纤维比例要高于科宝肉鸡同样证实了G.Renand等[14]的观点，即红肌纤维比例高的肌肉品质较好。为了进一步揭示优质型的清远麻鸡和快大型的科宝肉鸡在肌纤维性状上差异的机理，本研究采用Agilent鸡全基因组表达谱芯片首次探讨了两个品种鸡比目鱼肌在转录组水平上的差异，以期寻找与肌纤维发育及类型组成相关的基因。尽管荧光定量PCR与芯片两种方法得出的基因差异倍数并不完全相同，但两种方法下的基因表达趋势是高度一致的，表明本研究芯片分析得出的结果是可信的。

成年动物肌纤维组成及其收缩蛋白结构和功能的多样性在很大程度上由神经活动支配，因此，与肌肉发育、脂肪代谢、能量代谢和神经活动相关的基因均可能会影响肌纤维的发育和分化。本研究GO功能分类结果表明，参与到细胞过程、生理过程、生物学调控以及能量代谢等过程的基因在两品种中的表达具有显著差异，说明不同肌纤维类型具有不同的能量代谢调控特征，与A.Vidal-Puig等[15]报道结果一致。能量利用率对成熟肌纤维的形成以及肌纤维的增殖分化是至关重要的，M.Louis等[16]发现，培养的肌卫星细胞中能值水平直接影响肌纤维的肥大，M.Cagnazzo等[17]也发现成肌细胞分化和能量代谢密切相关。

肌纤维发育和类型组成受到多条信号通路和诸多因子的调节，本研究共发现18条与之相关的代谢通路，其中包括一些已知的在肌纤维发育与分化中具有重要作用的信号通路，如Hedgehog信号通路和Ca2+信号通路[18]。根据基因功能及其所在的信号通路，我们确定了20个影响肌纤维生长发育及分化的候选基因，其中包括7个已知的与肌纤维发育与类型组成相关的基因(PPARGC1B、PPARD、MYH1E、MYH1B、MYOG和MYO1A)。PPARD(Peroxisome proliferator-activated receptor delta)在多种组织如脂肪组织、骨骼肌和心中对脂质、脂蛋白和葡萄糖代谢调控起着关键作用[19]；PPARGC1B(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1 beta)是一种转录协同激活因子，也是细胞能量代谢和能量平衡的关键调节因子，可促进骨骼肌中线粒体的产生，并诱导氧化型肌纤维的形成[20]；上述两个基因在本研究清远麻鸡的比目鱼肌中均高表达，也进一步验证了Z.Arany等[20]的研究结果，即在促进氧化型肌纤维形成中发挥作用。MyoG基因主要在肌纤维分化末期表达，在肌细胞的早期分化过程中处于中心位置，本研究发现，该基因在科宝肉鸡中的表达量要高于清远麻鸡，可能也与品种特性有关。MYH1E、MYH1B和MYO1A与肌球蛋白的生物合成有关，不同类型的肌纤维特异性地表达各自特殊类型的肌球蛋白重链(MYH)，而MYH1即为快肌纤维特异性表达基因，故本研究MYH1E和MYH1B基因均在白肌纤维比例较高的科宝肉鸡中高表达。

本研究中，Wnt信号通路、mTOR信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、JAK-STAT信号通路以及一些跟能量代谢相关的信号通路也被富集为显著的信号通路，表明与能量代谢相关的信号通路和与肌肉发育相关的信号通路互作形成一个调控网络从而影响肌纤维的发育。在20个关键基因中有3个(PRKAG1、PRKAG3和PRKAR2B)是与能量代谢密切相关的。PRKAG1和PRKAG3分别是编码一磷酸腺苷激活蛋白激酶(A heterotrimeric serine/threonine protein kinase，AMPK) γ1和γ3亚基的基因，PRKAG1在各种组织中广泛表达，而PRKAG3则只在骨骼肌中特异性地表达。本研究中，PRKAG1和PRKAG3均在清远麻鸡比目鱼肌中高表达，可能是因为激活的AMPK复合物通过磷酸化作用抑制了糖原合成酶活性，降低了糖原的合成速率从而导致肌肉中糖原含量的下降。但PRKAG3在比目鱼肌中的高表达与M.Mahlapuu等[21]在人、大鼠和小鼠中的研究结果相悖，他们发现，PRKAG3主要在快速酵解型的白肌中表达，而在慢速氧化型的红肌中表达量较低。PRKAR2B是编码AMPKβ2亚基的基因，其在清远麻鸡比目鱼肌中的表达量要低于科宝肉鸡，结果与AMPKβ亚基中存在一个糖原结合位点从而抑制了AMPK的激活[22]这一事实相符。因此，值得扩大群体规模进一步研究这些基因表达与肌纤维类型之间的关系。

硬脂酰辅酶A去饱和酶5(Stearoyl-CoA desaturase5，SCD5)和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FASN)两个基因是脂肪酸合成关键酶基因，在科宝肉鸡比目鱼肌中具有较高的表达水平。SCD是催化包括棕榈酰CoA、硬脂酰CoA在内的饱和脂肪酸产生单不饱和脂肪酸合成的关键酶，对肌肉间脂肪沉积有着重要影响。本研究发现，一些能够抑制成肌细胞分化的生长因子如FGF7和GDF3，以及能够促进成肌细胞分化和肥大的诱导因子如IGF-I在两品种鸡的比目鱼肌中同样表现出较大的表达差异。Wnt信号通路是一条保守的信号通路，广泛存在于各种动物细胞内。Wnt家族是一个非常庞大的多基因家族，主要参与细胞的增殖与分化过程。本研究发现Wnt家族的Wnt11，Wnt5a，Wnt9a，Wnt2b和Wnt8b均表现为差异表达基因，不同的Wnt配体因其活性的差异可以激活不同的信号通路从而调控骨骼肌细胞增殖、分化、凋亡和迁移。K.Anakwe等[18]研究发现，不同的Wnt基因都可以不同程度的改变肌纤维总量和快慢肌纤维的组成，Wnt11能促使快肌纤维增多，这也与本研究该基因在科宝肉鸡中的表达水平较高的结果一致。因此，将这些基因作为影响不同肌纤维类型的代谢特征和收缩特性转录调控的新候选基因进行深入的研究具有一定的意义。

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(编辑郭云雁)

Identification of Differentially Expressed Genes for Myofiber Characteristics in Soleus Muscles between Qingyuan Partridge Chickens and Cobb Broilers

SHU Jing-ting#，ZHANG Ming#，SONG Chi，SHAN Yan-ju，XU Wen-juan，SONG Wei-tao，LI Hui-fang*

(JiangsuInstituteofPoultryScience，Yangzhou225125，China)

Key words:myofiber characteristics；microarray；differentially expressed gene；Qingyuan Partridge chicken；Cobb broiler

Abstract:In the modern chicken industry，fast-growing broilers have undergone strong artificial selection for muscle growth，which has led to remarkable phenotypic variations compared with slow-growing chickens.The present study was designed to explore the molecular mechanism underlying these phenotypes differences.Agilent cDNA microarray analyses were conducted to determine gene expression profiles of soleus muscle sampled at sexual maturity age of Qingyuan Partridge chickens (QY，112 d，a slow-growing Chinese breed with high meat quality) and Cobb broilers (CB，42 d，a commercial fast-growing broiler line).A systematic identification of candidate genes and new pathways related to myofiber development and composition in soleus muscles between the 2 breeds were analyzed.1 318 genes with at least 2-fold differences were identified in soleus muscles of QY and CB chickens.When slow-growing QY chickens were compared with fast-growing CB chickens，the expression of 501 genes were up-regulated，and 817 genes were down-regulated.These genes mainly were related to muscle development，energy metabolism or lipid metabolism processes.In addition，based on KEGG pathway analysis，it was found that in addition to pathways affecting myofiber development and differentiation (pathways for Hedgehog & Calcium signaling)，energy metabolism signaling pathways (Wnt signaling pathway，mTOR signaling pathway，MAPK signaling pathway，ErbB signaling pathway and JAK-STAT signaling pathway) were also enriched.Our data indicates that energy and muscle metabolism pathways might form a network，which influence the development of myofibers，20 genes were potentially related to myofiber development and composition.However，large scale analyses are still required to validate the role of the genes identified and ultimately to find molecular markers that can be used for selection or to optimize rearing practices.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.004

收稿日期：2015-01-22

基金项目：国家自然科学基金(31301967)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-42-G03)；江苏省自然科学基金(BK2012268)；江苏省农业科技自主创新资金项目(cx(15)1009)

作者简介：束婧婷(1980-)，女，江苏宿迁人，博士，副研究员，主要从事家禽遗传育种研究，Tel：0514-85599018，E-mail：shujingting@163.com；章明(1978-)，男，江苏姜堰人，硕士，副研究员，主要从事家禽遗传育种研究，E-mail：6259513@qq.com。二人共为第一作者 *通信作者：李慧芳，研究员，E-mail：lhfxf_002@aliyun.com

中图分类号：S813.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0025-09