HPV16 E7蛋白在宫颈癌中的作用研究进展

罗小兰综述，毛熙光审校（四川医科大学第一附属医院妇产科，四川泸州646000）

HPV16 E7蛋白在宫颈癌中的作用研究进展

罗小兰综述，毛熙光△审校
（四川医科大学第一附属医院妇产科，四川泸州646000）

宫颈肿瘤；人乳头瘤病毒16；基因，视网膜母细胞瘤；疫苗；综述

宫颈癌是全球女性恶性肿瘤的常见疾病，严重威胁女性的生命健康。我国每年的新发病例占世界总新发病例的30%左右，且宫颈癌患者以每年2%～3%的速度增长。近年来，多数宫颈癌调查结果显示发病年龄趋于年轻化。现有研究表明，人乳头瘤病毒（HPV）感染特别是高危型HPV感染是绝大多数宫颈癌癌前病变和宫颈癌的主要原因［1］。而HPV16与HPV18在宫颈癌高危型HPV中最常见。HPV16型感染多见于宫颈鳞状细胞癌（占宫颈癌的75%～80%），而HPV18多见于宫颈腺癌（占宫颈癌的20%～25%）。E6、E7基因持续表达是宫颈上皮细胞发生恶性转化及持续进展为宫颈癌浸润的必要条件［2］。而HPV16的早期基因E7是致癌的关键基因之一，E7基因编码的E7蛋白能与成视网膜母细胞瘤蛋白结合，进一步使宿主细胞绕过R点，由DNA合成前期（G1期）直接进入DNA合成期（S期），抑制宿主细胞的凋亡，导致细胞生长失控，对肿瘤血管的新生有促进作用，与E6蛋白协同使细胞发生永生化等。但值得注意的是，E7蛋白作为肿瘤特异性排斥抗原，含多个线性B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD4+细胞毒性T淋巴细胞表位，与主要组织相容性复合体（MHC）分子亲和力高、抗原性强，是研制HPV治疗性疫苗的首选靶抗原。E7在宫颈癌细胞生长、增殖、迁移及细胞周期调控等方面起着重要作用，与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关。

1　HPV16　 E7　蛋白的主要生物学特性

HPV16 E7蛋白由HPV16病毒的E区基因编码，共含有98个氨基酸的酸性磷酸蛋白，相对分子质量为16×103～18×103。HPV16 E7蛋白有3个主要的功能区域：Ⅰ区位于第1～15位氨基酸；Ⅱ区位于第16～37位氨基酸，Ⅱ区有1个与肿瘤抑制蛋白RB相结合的位点LXCXE，位于第22～26位氨基酸。LXCXE通过与RB结合，促进其降解，使原本与之结合的真核细胞起始转录因子E2F失去调控而释放，使细胞进入S期，引起细胞周期失调。Ⅱ区还含1个酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）位点，该位点上的第31、32位丝氨酸常被磷酸化，增加了HPV16 E7蛋白与转录因子IID（TFIID）的关键组件TATA合子结合蛋白的亲和性，而TFIID通过与启动子结合从而调控细胞的转化过程。Ⅲ区位于第38～98位氨基酸，该区域内含2个锌指结构和多个CTL的识别位点，可使细胞免疫应答增强［3］。现以CTL表位为基础，设计以E7蛋白位靶抗原的治疗性肽疫苗的研究越来越受到重视［4］。HPV16 E7蛋白锌指结构域内的LRLCV（第65～69位氨基酸）通过与核孔蛋白62（NUP 62）的FG区作用使E7能顺利进入细胞核内［5］。若E7蛋白的锌指结构发生突变，E7蛋白就失去使细胞转化的能力。

2　HPV16　 E7　蛋白在宫颈癌发生中的作用及其机制

2.1E7蛋白与pRB相互作用，使宿主细胞失去正常细胞周期调控作用细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。细胞周期分为G1期、S期、DNA合成后期（G2期）及细胞分裂期（M期）。HPV16 E7蛋白含有2个高度保守的CR1、CR2区域及1个羧基端。羧基端内存在2个锌指结构。CR2中Leu-X-Cys-X-Glu（LXCXE）结构，能与pRB相互作用，使其发生磷酸化，释放原本结合在pRB上的另一细胞转录因子E2F。E2F可作用于含有E2F结合位点的下游细胞周期调节蛋白的基因，引起一系列调节细胞周期的细胞因子的改变，如细胞周期蛋白、p16、p107、P130及c-Myc等，使宿主细胞绕过R点，由G1期直接进入S期，抑制宿主细胞的凋亡，导致细胞生长失控［6］。另有研究表明，E7蛋白能与叉头框蛋白M1（FoxM1）结合，并增加E7蛋白的转化活性及FoxM1的转录活性，从而使正常细胞周期失调［7］。

2.2HPV16 E7蛋白能够促进肿瘤血管新生任何肿瘤的发生都必须有血管的新生过程。肿瘤的新生血管与肿瘤的发生、发展及转移关系密切，因其能为肿瘤细胞提供足够的氧气和养料，且部分肿瘤细胞可通过新生的血管发生远处转移。血管生成的过程与低氧诱导因子-1α （HIF-1α）密切相关，且受到微环境中多种细胞因子的影响，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶等。在常氧环境下，HIF-1α脯氨酸发生羟基化，与von Hippel-Lindau蛋白结合，触发泛素-蛋白酶体蛋白水解，使其半衰期迅速变短［8］。HPV16 E7蛋白可诱导组蛋白去乙酰化酶与HIF-1α分离，使HIF-1α依赖受体活性上调，进而促进肿瘤血管的新生［9］。HP16 E7和RB蛋白结合释放转录因子E2F与HPV E7基因下游的核糖核苷酸还原酶亚基M2基因结合，产生活性氧，激活ERK1/2信号通路，使HIF-1α和VEGF表达上调来促进血管新生，最终导致癌症的发生［10］。免疫组织化学分析表明，RRM2水平与人类宫颈癌HPV16 E7水平呈正相关。HPV16表达E7只能使促血管生成因子表达显著增加，但并不足以诱导内皮细胞迁移。

2.3HVP16 E7蛋白与视黄酸受体β基因（RARB基因）的关系RARB基因是新发现的一种抑癌基因，其表达产物能抑制E6、E7基因的转录。RARB基因可通过分离转录因子AP-1与病毒调控区域，减弱HPV基因的表达。RARB基因甲基化可导致该基因沉默，使RARB表达缺失，对HPV16 E6、E7基因的抑制作用消失，从而E7蛋白的表达增高，促进了癌症的发生［11］。有研究表明，转染RARB质粒的Hela细胞可表达视黄酸，从而抑制单克隆细胞的生长［12］。但Gutiérrez等［13］提出HPV16 E7蛋白使被HPV16感染细胞的RARB mRNA 和RARB蛋白表达增高；在表达E7蛋白的细胞中，RARB的过表达进一步导致了肿瘤抑制基因p53R237C突变的发生。RARB基因属于肿瘤抑癌基因，理论上其在宫颈癌细胞中应不表达或表达下调，但多项研究已证实，RARB蛋白在宫颈鳞状细胞癌中表达增高，其具体机制目前仍不清楚。RARB作为新的抑癌基因，现仍有许多问题尚不清楚，其与HPV感染的关系，在宫颈鳞状上皮细胞癌中过表达的原因尚需进一步探索。

2.5E7蛋白与感染HPV16细胞的免疫反应及治疗性疫苗HPV16 E7蛋白可与E6蛋白协同改变细胞微环境，形成有利于癌细胞发生的微环境，逃避宿主的固有免疫应答，使宿主细胞的功能发生改变，导致宿主细胞的永生化。E6、E7蛋白还可作用于细胞内相关蛋白，引起宿主细胞发生转化，还可以通过影响宿主的免疫功能逃避宿主对转化细胞的免疫监视作用，造成HPV16的持续感染。持续性的高危型HPV感染是宫颈癌的重要原因。E6、E7蛋白使促炎性细胞因子，如白介素-18（IL-18）、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1和巨噬细胞炎性蛋白-3α等趋化因子表达下降，并能使抗炎分子IL-18结合蛋白高表达［14］，进而抑制免疫反应。E6、E7蛋白能通过操纵细胞内信号通路来抑制抗病毒转录因子的活化，包括核因子-κB（NF-κB）和干扰素等［15］。有研究表明，E7蛋白能通过改变核易位和p65乙酰化作用来阻断NF-κB的活化，进而降低咪喹莫特对HPV16病毒感染的治疗效果［16］。

随着科技的进步宫颈癌的治疗方法（手术、放疗、化疗技术）在不断提高，但每年仍然有成千上万的人死于宫颈癌［17］。现已有默克公司针对HPV6/16/18的四价疫苗和葛兰素史克公司针对HPV16/18的二价疫苗通过美国食品药物监督管理局审批，予以上市投入使用［18］。但这些预防性疫苗开始使用的时间建议在无性生活前（12岁前），接种对象是未被HPV感染的健康人群，且对已感染相关HPV的女性无治疗效果［19］。因此，迫切需要研发针对已感染HPV人群的治疗性疫苗。宫颈癌HPV治疗性疫苗是指通过机体的免疫作用消除或减少体内已被HPV感染的细胞，从而减少宫颈上皮内瘤变或宫颈癌的发生。E7肿瘤蛋白是一种外源性蛋白，仅在HPV感染的细胞中高表达［20］，且是宫颈癌发生过程中必不可少的关键结构。这些特性使得E7蛋白成为最适合的治疗性HPV疫苗的特异性靶抗原［21］。目前治疗性HPV疫苗的研制虽已经取得一定成果。Trimble等［22］已证实，针对HPV16 E6、E7蛋白的DNA疫苗VGX-3100疫苗对HPV16和HPV18感染所致的中、重度宫颈上皮内瘤变治疗效果显著，为宫颈上皮内瘤变患者提供了除手术治疗外的治疗方案。治疗性疫苗的形式多样化，除vgx-3100 类DNA疫苗外，还有肽类疫苗、蛋白疫苗、载体疫苗及细胞疫苗等。但治疗性疫苗仍有许多问题需要改善，比如怎样提高疫苗的安全性和提高疫苗的免疫原性等。

不同HPV亚型间的E7蛋白具有同源性。当E7与RAS蛋白结合时，能使其保持低表达水平，减弱其诱导细胞衰老的过程，从而导致细胞过度增殖；有研究发现，当E7蛋白在HPV16感染细胞中持续表达时，可使永生化细胞的端粒酶活性的稳定性进一步增高［23］。PT-3可通过抑制感染HPV的CaSki细胞表达E6、E7来诱导细胞凋亡的发生。PT-3能使CaSki和Hela的生长动力减缓，然而这一作用对HPV阴性的C33A细胞无效［24］。而E2蛋白针对E7蛋白与其他细胞内蛋白的关系仍在探索中。

当敲除CaSki细胞的HPV16 E6和E7基因后，宫颈癌CaSki细胞增殖受到抑制，能促进宫颈癌CaSki细胞凋亡，并降低宫颈癌CaSki细胞迁移和侵袭的能力［25］。

综上所述，E7蛋白作为HPV16 E7基因编码的关键肿瘤蛋白，在宫颈癌细胞生长、增殖、迁移及细胞周期调控等方面起着重要作用，与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关。因为HPV16 E7蛋白作为肿瘤特异性排斥抗原，含多个线性B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD4+CTL表位，与MHC分子亲和力高，具有很好的抗原性；仅在HPV16感染的细胞中表达，属于外源性蛋白；E7蛋白可在宿主细胞表面持续性表达，因为E7的持续性表达使其抗原性得以持续存在，这些因素都使得E7蛋白成为研制HPV治疗性疫苗的首选靶抗原。虽然HPV治疗性疫苗的研发和使用仍会面临许多挑战，但随着科技的发展，针对E7的治疗性HPV疫苗的进一步研发，对控制HPV感染所致子宫颈癌的发病率有着跨时代的作用。

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（2015-10-23）