转基因猪对异种移植的影响研究

李　涛，David Cooper KC综述，王　毅△审校（.南华大学附属第二医院肾移植科，湖南衡阳4000；.The Thomas E.Starzl Transplantation Institute，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA，USA，56）

转基因猪对异种移植的影响研究

李涛1，David Cooper KC2综述，王毅1△审校
（1.南华大学附属第二医院肾移植科，湖南衡阳421000；2.The Thomas E.Starzl Transplantation Institute，University of Pittsburgh，Pittsburgh，PA，USA，15261）

移植，异种；猪；转基因；凝血功能；炎症；人类补体调控蛋白；综述

对于器官衰竭的患者来说，器官移植是最好的治疗手段。尽管在过去的50年做了很大的努力，但这个问题仍未完全解决，事实上还有很多新的问题。纵观20世纪，有人尝试用动物器官作为临床移植器官的来源［1-2］。这些动物一般为非人类灵长动物（nonhuman primates，NHPs）。通过一些使用NHPs作为供者的实验发现，移植器官的生存时间都很短，经常只存活几分钟，最长也只持续几天。人们开始认识到NHPs不是很适合成为器官及细胞的供者。因此，在20世纪末期，人们开始将注意力转移到猪身上，用猪作为器官及细胞的供者，尽管猪的免疫障碍远远大于NHPs，但是猪作为供者有很大优势，特别是在目前这个基因时代，转基因猪孕育而生，给猪-人类提供了无限的前景。本文对转基因猪与影响异种移植物存活条件的因素进行综述，为未来的临床异种移植研究提供参考。

1　转基因猪诞生背景

据研究报道，我国每年等待器官移植的患者超过150万人，但其中仅有1万人能够幸运的等到供体，而异种移植却能解决供需不平衡，并且猪被认为是最合适的供体［3］。未经过基因处理过的猪，不能很好地阻止移植器官及细胞受到灵长动物免疫系统的攻击，这类猪被称之为野生型。野生型猪的器官移植到NHPs发生广泛的超急性排斥反应，类似于没有经过处理的人类血型不相容器官移植。在同种移植中，当受者对供者人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）高度敏感，有较高梯度的群体反应性抗体，即有可能发生超急性排斥反应。免疫抑制药物治疗很难阻止野生型猪的器官不发生超急性排斥反应。

20世纪80年代，发现猪器官的识别抗原在猪血管内皮细胞上。为了延长器官的生存，通过血浆置换去除受者免疫球蛋白。这种方法在人类血型不相容器官移植中取得了成功［4-6］。因此，人们设想将这种方法用于异种移植中［7-8］。然而异种移植（猪-灵长动物）的机制远远比灵长动物ABO血型不相容复杂，持续抗猪抗体产生，同时凝血功能紊乱、炎性反应等多种因素导致移植器官的衰竭及发生急性体液性异种移植排斥反应（acute humoral xenograft rejecton，AHXR）。因此，基因工程猪对异种移植有深远的意义。

2　α-1　，3　-半乳糖抗原（Gal抗原）敲除猪

人类抗猪细胞抗体的识别位点在猪血管内皮上，即Gal抗原，这是在异种移植上具有历史意义的重要发现［9］。人们尝试用免疫亲和柱等免疫吸附特异性去除受者抗Gal抗体［10］，但是结果与血浆置换效果相差无几。虽然能推迟器官排斥，但是没有真正延长器官的存活时间，即使联合免疫抑制药物治疗也没能阻止T细胞介导的抗体反应，移植物几天则失去功能。

当基因敲出技术成熟后，人们想到将基因工程运用到异种移植中。Gal抗原转移酶能加强Gal抗原在猪内皮细胞的表达。人们将猪Gal抗原转移酶敲除（GTKO）后，把这种转基因猪作为器官供者，选择表达低浓度抗猪抗体的狒狒作为受者，移植物心脏和肾脏的存活时间明显延长［11-16］。Tseng等［17］将敲出Gal抗原猪的心脏移植给8只狒狒，并配合使用抗体、阿司匹林等，结果6只狒狒存活了2～6个月。上述研究为异种移植开拓了新的里程碑。

3　人类补体系统

在转基因猪中，首先要克服的是组织灵长动物补体对移植物的攻击。当致病细菌存在于人类血液里，人类补体系统会像瀑布一样激活，然而却不会伤害人类本身组织。这是因为人类内皮细胞血管可表达人类补体调节蛋白（human complement-regulatory protein，CRPs）。野生猪也表达猪补体调节蛋白，但不能很好地阻止猪细胞不被人类补体攻击［18］。因此，意味着通过转基因技术，将表达人类CRPs基因导入猪中，如CD46、CD55、CD59，能很好地保护移植物不受NHPs补体的攻击。

在20世纪90年代，第一个表达人类CRPs，即表达CD55［19-22］猪成功培养，CD55也叫做DAF，是补体激活调节因子中的一员，它是补体活化经典通路的主要调节因子，表达于所有血清中的细胞。活化的CD55不仅是补体系统的抑制剂，而且广泛地表达于恶性肿瘤。同时表达CD46转基因组成功培养，相信不久的将来，更多的表达人类补体蛋白的基因将会成功导入猪中。

4　非Gal抗原敲除猪

猪器官移植物内皮细胞上除了表达Gal抗原外，同时还表达非Gal抗原，即使Gal抗原被敲出，仍有抗体与血管内皮上非Gal抗原结合，从而导致排斥反应。因此，人们通过很多努力去研究非Gal抗原的结构。直到1990年左右，才被人们认识，其中一种为N-羟己硫神经氨酸（NeuGc）。该抗原在猪身上表达，同时也在猩猩和亚洲猴子身上表达，而不在人类表达。因为人类不表达该抗原，所以产生抗NeuGc抗原抗体。因此可以说，NeuGc抗原是临床异种移植的一重要影响因素。因为猪和NHPs均表达该抗原，因此不适用于猪移植到NHPs的实验。

最近，不表达Gal及NeuGc抗原猪已近培育出来［23-24］，在试管实验中，用人类血浆和猪细胞共同培养，发现人类补体与GTKO/NeuGcKO猪细胞结合少于与单独GTKO猪的结合［25］。因此，培育Gal和NeuGc均不表达的猪对于临床异种移植有重要意义。

第2个重要的非Gal抗原被发现，为β1，4N-乙酸氨基半乳糖转移酶［26］。狒狒和大多数人类会产生与抗原结合的抗体。有证据表明，不表达这种抗原的猪细胞能减少人类血清抗体与之结合［25］。这种抗原也不在NHPs上表达，该抗原被敲出的猪也可能用于异种移植实验，Tector的团队已经培育出Gal、NeuGc、β1，4N-乙酸氨基半乳糖转移酶敲出的猪［25］。

5　表达人类凝血功能调控蛋白转基因猪

抗非Gal抗体、抗Gal抗体、补体沉积、先天免疫细胞激活的内皮细胞可导致血管微血管病和器官衰竭的发生［27-29］。纤维蛋白和血小板在移植器官血管中沉积，导致凝血因子等消耗，从而发生凝血功能紊乱。这将导致自发性的出血，如消化道出血等。

猪-人类灵长动物的器官移植能加强血管内皮细胞的激活，从而导致血栓微血管病变。例如，猪组织因子抑制途径不能成功抑制灵长动物Ⅹa因子。猪的血栓调节蛋白不能催化激活灵长动物蛋白C。同时，猪的血管性血友病因子又与过多的灵长类血小板聚集有关。凝血机制很复杂，不仅仅是组织因子在猪内皮细胞的高度表达和组织因子激活的增强，更是猪的血管内皮细胞直接暴露在灵长类的血小板和单核细胞下，从而激活组织因子。

因此，可以考虑通过转基因猪来克服这些凝血差异［30］。培养能表达人类凝血调节蛋白的猪，例如：血栓调节蛋白、血管内皮细胞C受体、组织因子途径抑制物、CD39、CD73等［31-34］。多转基因猪，而且多种抗凝血转基因猪已近培养成功［30］。

6　表达人类炎症调控蛋白转基因猪

越来越多的证据表明，在猪器官移植物失败的过程中，炎症扮演了重要角色，免疫反应与炎性反应往往是同时发生的，一些炎症因此会促进免疫细胞的活化，诱导免疫细胞释放细胞因子，加重炎性反应，同时，炎性反应也会影响免疫反应。Ezzelarab称之为异种移植物受者的系统炎性反应 （systemic inflammatory response in xenograft recipient，SIXR）。IL-6在炎性反应中扮演了重要角色，T细胞及巨噬细胞分泌IL-6，刺激免疫应答。同时，纤维蛋白的形成及裂解是炎症表达的一部分，纤维蛋白的降解过程，包括D-二聚体，对炎性反应的急性反应、IL-6分泌有一定的影响。

其他细胞因子及趋化因子也参与其中。所以，培养含有人类抗炎基因的转基因猪是很有意义的。人们已发现血红素氧合酶-1（HO-1）、A20能起到抗炎作用。在GTKO/hCRP转基因猪培养成功后，培养转基因猪表达A20 或HO1是可能的［35-37］。

7　抑制T细胞免疫适应反应转基因猪

即使运用其他转基金猪器官作为供者来源，也难以避免适应性T细胞反应，包括同种及异种移植。因此，有效的药物免疫抑制方案被运用于移植中，例如他克莫司、环孢素、MMF等，甚至是联合运用。这些方案可适用于同种移植，但是在异种移植中却不能成功，除非给予大剂量的药物，这必然会增加药物所带来并发症的危险，如感染等。

然而，最新研究发现，阻止T细胞共同刺激路径已经在异种移植中取得了成功。比如：（1）CD40/CD154 T细胞共同刺激途径，通过抗CD154单克隆抗体抑制该通路，能有效阻止激发抗体反应。但是该抗体能引起同种及异种移植血栓的形成，因此，不适合用于临床。抗CD40单克隆抗体，同样能阻止CD40/CD154 T细胞共同刺激途径，在Iwase等［38］和Iwase等［39］实验小组的异种移植中，该抗体有很好的作用。（2）B7/CD28 T细胞共同刺激途径，通过CTLA4-Ig（abatacept）和（belatacept）可以阻断该通路。更少的免疫药物治疗能维持移植器官功能是最好的，能减轻其带来的并发症。因此，通过基因工程直接组织T细胞适用性应答是最好的手段。Phelps和他的同事在2009年已经将CTLA4-Ig诱导到猪身上。在同种移植实验中，接受表达CTLA4-Ig基因猪器官的受者，血液中含CTLA4-Ig的浓度是通过药物CTLA4-Ig的很多倍，因此，该实验相当成功。另外，将人类CD47基因导入猪，CD47又称“免疫躲避”蛋白，能使含该基因的猪细胞躲避人巨噬细胞的激活和吞噬［40］。目前，CD47转基因猪已培育成功。

8　结　语

虽然转基因猪有很大的优势，然而转基因猪仍存在一直困扰人们数年的问题，即猪器官中潜在的内源性逆转录病毒，在猪身体里面不会有毒性，但当猪的细胞和人的细胞接触时，这种病毒会从猪的基因组进入人的基因组中，从而导致人感染，更重要的是担心这些内源性逆转录病毒在人类中互相传播，异种病毒传播最典型的例子就是艾滋病病毒（一种逆转录病毒）从灵长类动物传播到人类。人类没有天然抗这种猪病毒的免疫机制。人们隔离供者猪，同时严密监测，有些病毒可以通过监测发现，然而有些病毒却不能。最近令人兴奋的消息是，美国《Nature》杂志网络报告，有学者利用一种新的基因编辑技术，敲出了猪基因组中可能有害的病毒基因。

目前，在中国广州转基因猪的眼角膜已用于人类临床移植。异位心脏移植物在NHPs中能保持很好的功能超过12个月，可取代心脏移植在NHPs中能存活近2个月。转基因猪的胰岛细胞移植到患有糖尿病的NHPs中，正常血糖维持超过1年，且猪的胰岛素跟人类胰岛素很相似。转基因猪-NHPs肾移植最长存活时间超过12个月，且死于感染，肾功能仍保持良好。然而肝脏移植在NHPs中，移植物功能仅仅能维持几天，这是因为特殊的凝血功能紊乱问题，特别是猪移植物血管内皮细胞及Kupffer细胞，细胞吞噬受者血小板。

在这个医学飞速发展、器官移植盛行的时代，基因工程高速发展，相信在不久的将来，转基因猪异种移植能取代同种移植，成为治疗终末期器官衰竭的重要治疗途径。

［1］Taniguchi S，Cooper DK.Clinical xenotransplantation：past，present and future［J］.Ann R Coll Surg Engl，1997，79（1）：13-19.

［2］Cooper DK.A brief history of cross-species organ transplantation［J］.Proc （Bayl Univ Med Cent），2012，25（1）：49-57.

［3］Cooper DK.The case for xenotransplantation［J］.Clin Transplant，2015，29（4）：288-293.

［4］Alexandre GP，De Bruyère M，Squifflet JP，et al.Human ABO-incompatible living donor renal homografts［J］.Neth J Med，1985，28（6）：231-234.

［5］Alexandre GP，Squifflet JP，De Bruyère M，et al.Present experiences in a series of 26 ABO-incompatible living donor renal allografts［J］.Transplant Proc，1987，19（6）：4538-4542.

［6］Cooper DK，Ye Y，Niekrasz M，et al.Specific intravenous carbohydrate therapy.A new concept in inhibiting antibody-mediated rejection—experience with ABO-incompatible cardiac allografting in the baboon［J］.Transplantation，1993，56（4）：769-777.

［7］Alexandre GP.From ABO-incompatible human kidney transplantation to xenotransplantation［J］.Xenotransplantation，2004，11（3）：233-236.

［8］Stussi G，West L，Cooper DK，et al.ABO-incompatible allotransplantation as a basis for clinical xenotransplantation［J］.Xenotransplantation，2006，13（5）：390-399.

［9］Kobayashi T，Cooper DK.Anti-Gal，alpha-Gal epitopes，and xenotransplantation［J］.Subcell Biochem，1999，32：229-257.

［10］Lambrigts D，Sachs DH，Cooper DK.Discordant organ xenotransplantation in primates：world experience and current status［J］.Transplantation，1998，66（4）：547-561.

［11］Kuwaki K，Tseng YL，Dor FJ，et al.Heart transplantation in baboons using alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout pigs as donors：initial experience［J］.Nat Med，2005，11（1）：29-31.

［12］Tseng YL，Kuwaki K，Dor FJ，et al.alpha1，3-Galactosyltransferase geneknockout pig heart transplantation in baboons with survival approaching 6 months［J］.Transplantation，2005，80（10）：1493-1500.

［13］Yamada K，Yazawa K，Shimizu A，et al.Marked prolongation of porcine renal xenograft survival in baboons through the use of alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout donors and the cotransplantation of vascularized thymic tissue［J］.Nat Med，2005，11（1）：32-34.

［14］Hisashi Y，Yamada K，Kuwaki K，et al.Rejection of cardiac xenografts transplanted from alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout（GalT-KO）pigs to baboons［J］.Am J Transplant，2008，8（12）：2516-2526.

［15］Shimizu A，Yamada K，Yamamoto S，et al.Thrombotic microangiopathic glomerulopathy in human decay accelerating factor-transgenic swine-tobaboon kidney xenografts［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（9）：2732-2745.

［16］Shimizu A，Hisashi Y，Kuwaki K，et al.Thrombotic microangiopathy associated with humoral rejection of cardiac xenografts from alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout pigs in baboons［J］.Am J Pathol，2008，172（6）：1471-1481.

［17］Tseng YL，Kuwaki K，Dor FJ，et al.Alpha1，3-Galactosyltransferase geneknockout pig heart transplantation in baboons with survival approaching 6 months［J］.Transplantation，2005，80（10）：1493-1500.

［18］Atkinson JP，Oglesby TJ，White D，et al.Separation of self from non-self in the complement system：a role for membrane cofactor protein and decay accelerating factor［J］.Clin Exp Immunol，1991，86（1）：27-30.

［19］Charreau B，Ménoret S，Tesson L，et al.Protection against hyperacute xenograft rejection of transgenic rat hearts expressing human decay accelerating factor（DAF）transplanted into primates［J］.Mol Med，1999，5（9）：617-630.

［20］Rosengard AM，Cary NR，Langford GA，et al.Tissue expression of human complement inhibitor，decay-accelerating factor，in transgenic pigs.A potential approach for preventing xenograft rejection［J］.Transplantation，1995，59（9）：1325-1333.

［21］Cozzi E，White DJ.The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans［J］.Nat Med，1995，1（9）：964-966.

［22］Langford GA，Cozzi E，Yannoutsos N，et al.Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation using YAC technology［J］. Transplant Proc，1996，28（2）：862-863.

［23］Lutz AJ，Li P，Estrada JL，et al.Double knockout pigs deficient in N-glycolylneuraminic acid and galactose alpha-1，3-galactose reduce the humoral barrier to xenotransplantation［J］.Xenotransplantation，2013，20（1）：27-35.

［24］Li P，Estrada JL，Burlak C，et al.Efficient generation of genetically distinct pigs in a single pregnancy using multiplexed single-guide RNA and carbohydrate selection［J］.Xenotransplantation，2015，22（1）：20-31.

［25］Estrada JL，Martens G，Li P，et al.Evaluation of human and non-human primate antibody binding to pig cells lacking GGTA1/CMAH/beta4GalNT2 genes［J］.Xenotransplantation，2015，22（3）：194-202.

［26］Byrne GW，Du Z，Stalboerger P，et al.Cloning and expression of porcine beta1，4 N-acetylgalactosaminyl transferase encoding a new xenoreactive antigen［J］.Xenotransplantation，2014，21（6）：543-554.

［27］Kuwaki K，Tseng YL，Dor FJ，et al.Heart transplantation in baboons using alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout pigs as donors：initial experience［J］.Nat Med，2005，11（1）：29-31.

［28］Shimizu A，Hisashi Y，Kuwaki K，et al.Thrombotic microangiopathy associated with humoral rejection of cardiac xenografts from alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout pigs in baboons［J］.Am J Pathol，2008，172（6）：1471-1481.

［29］Houser SL，Kuwaki K，Knosalla C，et al.Thrombotic microangiopathy and graft arteriopathy in pig hearts following transplantation into baboons［J］. Xenotransplantation，2004，11（4）：416-425.

［30］Ayares D，Vaught T，Ball S，et al.Genetic engineering of source pigs for xenotransplantation：progress and prospects［J］.Xenotransplantation，2013，20（3）：361-408.

［31］Roussel JC，Moran CJ，Salvaris EJ，et al.Pig thrombomodulin binds human thrombin but is a poor cofactor for activation of human protein C and TAFI［J］. Am J Transplant，2008，8（6）：1101-1112.

［32］Petersen B，Ramackers W，Tiede A，et al.Pigs transgenic for human thrombomodulin have elevated production of activated protein C［J］.Xenotransplantation，2009，16（6）：486-495.

［33］Miwa Y，Yamamoto K，Onishi A，et al.Potential value of human thrombomodulin and DAF expression for coagulation control in pig-to-human xenotransplantation［J］.Xenotransplantation，2010，17（1）：26-37.

［34］Lee KF，Salvaris EJ，Roussel JC，et al.Recombinant pig TFPI efficiently regulates human tissue factor pathways［J］.Xenotransplantation，2008，15（3）：191-197.

［35］Oropeza M，Petersen B，Carnwath JW，et al.Transgenic expression of the human A20 gene in cloned pigs provides protection against apoptotic and inflammatory stimuli［J］.Xenotransplantation，2009，16（6）：522-534.

［36］Petersen B，Lucas-Hahn A，Lemme E，et al.Generation and characterization of pigs transgenic for human hemeoxygenase-1（hHO-1）［J］.Xenotransplantation，2010，17（2）：102-103.

［37］Petersen B，Ramackers W，Lucas-Hahn A，et al.Transgenic expression of human heme oxygenase-1 in pigs confers resistance against xenograft rejection during ex vivo perfusion of porcine kidneys［J］.Xenotransplantation，2011，18（6）：355-368.

［38］Iwase H，Liu H，Wijkstrom M，et al.Pig kidney graft survival in a baboon for 136 days：longest life-supporting organ graft survival to date［J］.Xenotransplantation，2015，22（4）：302-309.

［39］Iwase H，Ekser B，Satyananda V，et al.Pig-to-baboon heterotopic heart transplantation—exploratory preliminary experience with pigstransgenic for human thrombomodulin and comparison of three costimulation blockadebased regimens［J］.Xenotransplantation，2015，22（3）：211-220.

［40］Tena A，Kurtz J，Leonard DA，et al.Transgenic expression of human CD47 markedly increases engraftment in a murine model of pig-to-human hematopoietic cell transplantation［J］.Am J Transplant，2014，14（12）：2713-2722.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.023

A

1009-5519（2016）04-0540-04

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（2015-12-07）