中药及组方物质基础研究进展

云　璐，王　荣，赵　海，杨　海，2

(1. 山东省青岛市中心医院，山东 青岛 266042；2. 中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室/医药学院,山东 青岛 266003)



中药及组方物质基础研究进展

云璐1，王荣1，赵海1，杨海1，2

(1. 山东省青岛市中心医院，山东 青岛 266042；2. 中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室/医药学院,山东 青岛 266003)

[关键词]中药；组方；物质基础研究；方法

中药及组方是中药临床使用的主要表现形式，对于中药组方药理活性成分的研究是中药现代化及国际化的必有出路。由于中药组方成分的复杂性、多样性，药理作用的多靶点、多途径、多效应等，给中药组方物质基础研究带来挑战。传统中药组方的物质基础研究多集中在单味药的物质基础的研究，取得了一些成果，如青蒿素、石杉碱甲、川芎嗪、五味子素、联苯双酯、银杏内酯等，但是这种拆方研究没有体现中医治疗疾病的整体性、系统性，没有全面阐述中药组方效应的物质基础。随着药学研究多学科多领域的交叉发展，不断涌现出一些新思路、新方法、新技术，为阐明中药组方的物质基础提供了帮助。

1中药有效部位(群)研究

中药有效部位是指从单味药材或组方中提取得到的具有相近化学性质的一类化合物(药效成分群)，有效部位要求标准是：提取物中某一类有效成分可控量达到50%以上；有效部位群是几类有效部位的集合，标准是某几类化学成分的可控总量达50%以上[1]。有效部位(群)的研究模式与中医药传统理论相吻合，注重中医药的“整体观”“模糊思维模式”“性味归经”及中药“君、臣、佐、使”配伍理论，基本能够阐述清楚是什么物质在中药或组方中起治疗作用及这些物质是怎样在起治疗作用的“两个基本讲清”理论[2-3]。中药有效部位(群)的研究方法过滤掉无效成分，突出有效组分，体现中药多成分的特点，又能对药物活性成分进行富集，达到“去伪存真”。该方法对提高中药制剂质量控制的针对性，同时提高中药制剂的质量稳定性。组方CBN的有效部位为葛根黄酮和三七皂苷，总含量在80%以上，用于治疗脑血管系统，李敏等[4]对组方CBN的有效部位的药代动力学进行了研究，表明该方法实验因素相对可控，既体现了中药组方的多成分性，又解决了中药组方体内药代动力学的局限性。在抗病毒中草药的组方研究中，黄升海等[5]从黄芪、黄芩、柴胡等组方中药中提取有效成分组成混合体，制成中药有效部位新药TCM-ES，该新药具有抗流感病毒作用，对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。周明学等[6]对活血、解毒、活血解毒中药有效部位(三七总皂苷、黄连提取物、虎杖提取物、大黄醇提物)改善及稳定斑块、调节血脂、抑制炎症反应进行研究，发现该中药组方的有效部位药理作用明确，作用机制清楚。中药有效部位(群)研究起步较晚，在中药有效部位“有效性”的筛选及确定方面还存在一些问题，如缺乏主动探索和比较药理学研究意识[7]。中药有效部位确立要在中医药理论指导下，根据中药药性、功效采用相对应的药理学指标建立模型，对各组分进行活性追踪，利用现代分析技术手段确定大类成分类型，最终确定有效部位[8]。

2中药指纹图谱

中药指纹图谱具有特征性、稳定性、整体性及模糊性等特点，能客观地反映中药组方化学成分的复杂性及整体性。目前中药指纹图谱测定方法较多，如色谱法、光谱法、及多维指纹图谱、中药蛋白质指纹图谱、扫描电镜指纹图谱、计算机图像指纹图谱、基因组学指纹图谱等。多维指纹图谱能在色谱分离的同时运用不同光谱检测器进行在线检测，建立不同物质属性多维图谱[9]。胡建兰等[10]采用高效液相色谱法(HPLC)采用二极管阵列检测器(DAD)对凉膈散汤剂建立指纹图谱，共确定共有峰22个，其中8个色谱法确定其化学成分，该指纹图谱能体现凉膈散汤剂的整体特征。聂晶等[11]采用HPLC-UV对生血宁片的特征指纹图谱进行了研究，得到了分离度及重复性均较好的片剂特征指纹图谱，并利用UPLC-DAD-Q-TOF-MS技术对其主要色谱峰进行了初步归属，为更好地控制生血宁片的质量提供了可靠依据。耿放等[12]建立了桂枝茯苓丸脂溶性成分GC-MS指纹图谱从整体定性方面评价桂枝茯苓丸的质量优劣。孙国祥等[13]建立了防风通圣丸的高效液相色谱指纹图谱、紫外光谱指纹图谱、红外光谱指纹图谱及热值谱．形成多元多维方法交叉评价防风通圣丸质量的方法。陈新新等[14]建立了六味地黄丸的五波长高效液相色谱指纹图谱、紫外指纹图谱和导数指纹图谱，为其药效物质均一性的评价提供了一种有效的方法。多维中药指纹图谱实现了分析方法和检测方法的多维化，能获得到中药组方化学成分的全信息分析而形成立体多息谱。非线性化学指纹图谱利用非线性反应，如化学振荡、化学斑图等化学混沌反应，测定中药等成分极为复杂的样品[15]。向凤琴等[16]以Mn2+-H+-BrO3--CH3COCH3，和作为耗散物的中药还原活性成分作为测定指纹图谱的基本非线性化学体系，测定了9批中药的非线性化学指纹图谱,该图谱科学直观反映中药的定量信息与中药成分之间的定量关系。魏航等[17]将灰色系统理论应用在中药指纹图谱模式识别中，比较指纹图谱特征变量数据序列与理想图谱特特征之间的关联度，从而达到品种识别和质量评价的目的。另外还有研究对中药建立了三维荧光指纹图谱数据库[18]，邹慧琴等[19]将逐步辨别法应用在气味中药指纹图谱中。这些依托计算机模型及程序运算的新技术新方法扩大了指纹图谱在中药组方中应用，为加强中药质量控制及中药发挥药效的物质基础研究提供了方法参考。

3中药血清学

按照血清药理学的理论，经口服给药后有效成分入血，进入体循环才能发挥药效，这为中药组方物质基础的血清学研究提供了理论支持。中药组方成分多样复杂，利用血清学研究物质基础可以排除干扰，较为准确、真实地反映中药组方药效物质基础，通过现代微量药学分析技术，如高效液相色谱法、质谱法等测定血清中物质及代谢产物，可以将药效与物质基础联系起来。该方法最早由田代真一提出。付克等[20]运用HPLC-UV法分析了大鼠口服柴芩清肝汤后血中移行成分，共检测14个移行成分，其中8个为该中药组方的原型成分，6个为体内代谢产物，这为柴芩清肝汤药效物质基础研究开辟了新的途径。金慧等[21]运用中药血清学原理对葛根芩连汤的动物实验共发现31个入血成分，其中15个为该中药组方的原型成分，13个为体内代谢产物，3个为新物质。有研究通过给大鼠服用七味消炎汤后进行血清分析，确定了该中药组方药效的物质基础为芦荟大黄素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷-7、番泻苷A[22]。在对芍药甘草组方的研究中，张梁等[23]对该中药组方血中移行成分进行归属，使用HPLC法共测定18个组分，其中13个为组方原型组分，3个为代谢组分。 曹艺等[24]建立了归苓片血清移行组分的高效液相指纹图谱，并对指纹图谱进行了成分归属。在对六味地黄丸血中移行成分的研究中，孙晖等[25]将六味地黄丸主要血中移行成分添加到大鼠成骨细胞培养液中，测MTT法测定细胞增殖速度，结果发现血中移动行成分中莫诺苷、獐牙菜苷、马钱子苷是其治疗骨质疏松的药效物质基础；王喜军等[26]通过随机对照实验同样发现上述三种物质是六味地黄丸补肾丸补肾的主要药效成分。由于血清本身成分复杂，受内源性物质的影响某些中药活性微量成分可能无法检测；另外血清中个体差异大，不同病理生理状态对实验结果的影响较大，这些都使得血清药理学的发展受到制约。

4高通量筛选

中药组方成分相对复杂，活性产物鉴定、活性成分筛选相对困难且工作量大，高通量筛选技术解决了中药中一些成分药理作用强，含量低，难以纯化和筛选的难题[27]。目前高通量筛选技术主要包括生物芯片技术[28]、亲和超滤技术[29]、生物色谱技术[30]等。

目前在生物芯片技术中应用最多的为基因芯片，是中药基因组学研究的主要工具[31]。基因芯片技术为中药组方活性成分筛选、药效作用靶点、毒性反应等研究提供高通量、自动化分析。Rho等[32]对六味地黄丸衍生方醇提取物抗衰老作用机制进行研究，发现实验大鼠海马区脑磷脂甲基转移酶及甲状腺素转运蛋白等相关基因高度表达。Bonham等[33]采用基因芯片对中药成分PC-SPES治疗前列腺癌的作用机制进行研究，发现与细胞周期调控、细胞结构和雄激素水平有关。在中药组方对糖尿病的治疗研究中，姜德友等[34]通过基因芯片研究中药糖心康对糖尿病大鼠心肌基因表达，结果发现中药组方的作用明显优于有效成分作用。在对中医诊断肾虚证的研究中，韩清民等[35]利用基因芯片技术检测补肾中药对骨关节炎关节软骨的基因表达，结果表明补肾中药能上调软骨细胞抗凋亡和增殖基因，抑制炎症因子延缓软骨退行性病变。中药及组方可以通过多种途径抑制肿瘤微血管生长[36]。托娅等[37]利用基因芯片技术，从基因水平解释抗肿瘤血管生成中草药的有效组分T3的分子机制。

亲和超滤技术是将亲和层析的高选择性和超滤技术的高处理能力有效结合的技术[38]，该技术在小分子药物筛选及药物代谢方面研究较多[39-41]。由于该技术具有用量少，特异性高，灵敏度高等特点，中药组方的研究也逐渐开展，有研究利用离心超滤-HPLC-MS联用技术研究中药忍冬与小牛胸腺DNA有结合活性的化合物[42]。吴新安等[43]利用生物亲和超滤技术以COX2酶为靶酶，在中药提取物中加入该靶酶抑制剂塞来昔布及逆行筛选，结合HPLC-DAD和HPLC-MS技术进行快速分离检测，成功分离目标化合物塞来昔布。陶益等[44]采用亲和超滤耦联HPLC-MS快速检测山楂叶中的α-淀粉酶抑制剂的3个活性成分。有研究利用离心超滤-HPLC-DAD-MS联用研究忍冬与小牛胸腺DNA在抗肿瘤、抗病毒、抗菌等反面的活性化合物[45]。另外近年来超滤技术在苷类、多糖类物质中均有应用[46]。

目前常规色谱分离手段如液相色谱、质谱、气相色谱在中药成分研究中应用广泛，但是同样存在一些不足，如注重分离及结构分析，无法在线进行药理活性测定。将色谱技术与分子生物技术结合形成了生物色谱技术。该技术将将有活性物质键合在载体上，形成固定相，根据色谱原理进行分离、鉴定、活性研究等[47]，这些活性物质主要有生物大分子、靶标或蛋白、活性细胞膜、活细胞等。Wang等[48]将人血清白蛋白键合硅胶柱以此分析龙胆泻肝汤的活性组分的生物指纹图谱，实验对100种组分进行了分离和分析。毛希琴等[49]将高效液相色谱固定化载体蛋白色谱、固定化脂质体色谱联用模拟中药药代动力学过程，并对川芎的活性成分进行筛选，结果得到既有细胞膜活性成分又有载体蛋白结合能力的成分并对其中的2种进行了结构鉴定。Tan等[50]用牛血清蛋白生物整体柱对当归提取液进行了方法学考察，在梯度洗脱的条件下分离得到2个组分，采用HPLC和气质联用确证2组分共5种成分来自当归提取液。Dong等[51]采用红细胞膜提取和HPLC分析当归中活性成分。有研究采用人血小板提取与LC-DAD-ESI-MS/MS联用对三七中抗血小板聚集成分进行了检测，证实了该方法的可行性[52]。

5中药代谢组学

代谢组学(Metabonomics)的概念首次由Jeremy Nicholson教授提出[53]，是研究生物体新陈代谢的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质的科学。中药物质基础的研究应该与中药药理作用的多成分、多靶点、协同作用等特点相适应。在现代中药研究中，代谢组学对于模型识别和确证、作用机制、药物有效性和安全性、中药资源和质量控制研究等方面具有理论意义和应用价值[54]。中药代谢组学主要采用核磁共振(NMR)技术、色谱质谱联用(GC-MS LC-MS)技术，建立一种非破坏性、整体、动态的研究方法，以此揭示中药治疗疾病过程中一系列机体化学变化，从而发现中药组方的物质基础[55]。中药代谢组学在中药组方配伍规律的研究方面，Keiko等[56]采用CE-MS技术对当归芍药散提取物进行高通次级代谢产物筛选，东鉴定119个次级代谢产物，通过与组方中单味药成分对比发现组方中茯苓、苍术有利尿作用，当归、石斛有调理气血功能。柳长凤等[57]基于代谢组学技术采用主成分分析法和正交偏最小二乘-判别分析法对获得的数据进行处理，分析了黄连解毒汤组方中君臣佐使的配伍规律。有研究采用NMR对牛黄解毒片配伍进行研究发现大黄、黄芩、桔梗和甘草课题调节能量、胆碱、氨基酸代谢，并缓和雄黄的毒性作用[58]。Wang等[59]同样采用NMR法通过偏最小二乘-判别分析对朱砂安神丸不同配伍进行研究，结果发现朱砂安神丸可以抑制单一朱砂对肝脏和肾脏毒性作用。近年来有研究利用中药代谢组学方法对黄连解毒汤、平肝方、麝香保心丸、金匮肾气丸、逍遥散、双龙方、四逆汤、通心络胶囊、温心方、下淤血汤、知柏地黄丸等进行药效作用机制研究。由于代谢组学很难全面检测代谢终端产物，不能对所有代谢产物进行定量、定性，不同的分析方法可能得到的分析结构不同，个体差异对实验结构的影响较大、无完善的中药代谢数据库等，这些都是中药代谢组学所面临的问题。相信随着上述问题的解决，中药代谢组学在中药组方物质基础、作用机制、中药毒性反应、活性成分筛选等方面有广泛的应用前景。

中药组方物质基础研究是中药药理活性研究的基础，是“两个基本讲清”的基本内容和重要环节。中药组方成分的复杂性决定了其物质基础研究方法的多样性，通过不同研究方法对中药组方药理活性成分进行阐明，为中药组方深度开发、市场推广及临床使用提供理论基础和数据支持。

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[收稿日期]2015-12-10

[中图分类号]R961

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)14-1589-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.041

[基金项目]青岛中医科研计划(2015-zyy026)；山东省中医药科技发展计划(2015-382)

[通信作者]杨海，E-mail：teaplate79@medmail.com.cn