三七对大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表达的影响

王雁彬，李廷荃，化金凤，张晓园

三七对大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表达的影响

王雁彬1，李廷荃2，化金凤1，张晓园1

目的 研究三七对大鼠下肢缺血后毛细血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 选取雄性SD大鼠60只，体重250 g～300 g，随机取20只为假手术组，仅暴露股动脉但不结扎股动脉及其分支；其余40只均采用左下肢股动脉结扎及分支剔除术，造成大鼠下肢缺血模型，造模后随机分为模型组和三七组。分别在术后3 d、14 d后用免疫组化法测定缺血组织微血管密度和VEGF蛋白相对表达量。结果 三七组在术后3 d及14 d的MVD值高于假手术组(P<0.05)；与模型组比较，三七组术后3 d MVD值差异无统计学意义，三七组术后14 d MVD值高于模型组(P<0.05)；三七组术后14 d的MVD值显著高于术后3 d(P<0.05)。三七组在术后3 d及14 d VEGF的表达高于模型组及假手术组(P<0.05)。结论 三七可以促进大鼠缺血下肢毛细血管密度增加，促进VEGF表达，促进血管新生。

下肢缺血；三七；毛细血管密度；血管内皮生长因子

下肢缺血疾病其主要原因是动脉狭窄或闭塞而引起下肢动脉的供氧量与组织静息状态下维持生存能力的氧气需求量之间不均衡所致，其临床主要表现为因相应供血区域缺血、缺氧引起的间歇性跛行、静息痛、溃疡及坏疽，严重者可出现全身中毒症状[1]，严重影响病人生存时间和生活质量。三七中的主要成分三七总皂苷(PNS)通过调节脂质代谢，抑制血管平滑肌细胞的增殖，抗氧自由基，抗凝血、促纤溶、抑制血小板聚集、改善高凝状态而起到抗动脉粥样硬化(AS)的作用[2]。本研究通过对大鼠下肢缺血模型中毛细血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的观察，探讨三七对大鼠下肢缺血后的新生作用影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂 SD大鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK(军)2012-0004，雄性，体重250 g～300 g。SP免疫组化试剂盒及抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体，购自北京博奥森公司。

1.2 大鼠下肢缺血模型的制备及分组 10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)行大鼠腹腔注射麻醉，选左侧腹股沟中点向膝部作一长度约1.5 cm的纵行切口，紧贴腹股沟下方分离股动脉主干，行股动脉结扎及分支剔除术，造成下肢血管缺血模型。造模后随机分为两组，模型组予以生理盐水，三七组给予三七。

1.3 中药制备及给药方法 三七组将中药三七用普通粉碎机初粉后再用超微粉碎机制成极细粉，温开水调，搅拌匀，灌胃备用，给药剂量为0.571 g/(kg·d)。模型组和假手术组灌服蒸馏水1 mL/100 g，每日1次，连续14 d。

1.4 检测指标 术后3 d、14 d，各组取大鼠20只，用免疫组化法观测缺血下肢毛细血管密度及VEGF的表达。

1.4.1 缺血组织中毛细血管密度的测定 取大小为0．5 cm的缺血下肢内收肌肌肉2块～3块，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，用4%的多聚甲醛固定，将4 μm的组织经石蜡包埋后连续切片，切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60 ℃过夜，再经脱蜡，抗原修复，PBS洗3次，5 min，再按照美国ZYMED公司SP系列试剂盒即过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒说明书进行标本染色，然后进行400倍的显微照相。

1.4.2 缺血组织中VEGF的表达 将组织切片以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体进行免疫组化染色，棕黄色颗粒为VEGF阳性，采用图像分析系统测定缺血区400倍视野下的光密度值，每张切片观察7个视野，取均数作为VEGF蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情况 分离、结扎和切断下肢血管的效果明显。3组大鼠无死亡，三七组和模型组的大鼠均有不同程度的活动障碍，3 d后伤口渐愈合，14 d后痂脱落，未见坏死。

2.2 3组术后3 d及14 d的MVD值比较 三七组在术后3 d及14 d的MVD值高于假手术组(P<0.05)；与模型组比较，三七组术后3 d MVD值差异无统计学意义，三七组术后14 d MVD值高于模型组(P<0.05)；与假手术组比较，模型组术后14 d MVD值高于假手术组(P<0.05)，三七组术后14 d的MVD值显著高于术后3 d(P<0.05)。详见表1。

表1 3组术后3 d及14 d的MVD值比较(±s)

2.3 3组术后3 d及14 d VEGF的表达比较 三七组在术后3 d及14 d VEGF的表达高于模型组及假手术组，三七组与模型组比较，缺血组织中VEGF有增高趋势，提示三七可上调下肢缺血后VEGF的表达(P<0.05)；三七组与假手术组比较，VEGF增高(P<0.05)；模型组与假手术组比较，模型组VEGF有增高趋势，表明缺血后的组织VEGF会应激性增高(P<0.05)；三七组术后3 d和14 d两个时间点相比，VEGF表达差异无统计学意义。详见表2。

表2 3组不同时间点VEGF表达(±s)

3 讨 论

3.1 VEGF、MVD与血管新生的关系 VEGF是一种肝素结合的二聚体多肽糖蛋白，能特异地作用于血管内皮细胞，促使血管内皮细胞分裂增殖、增生和转移，从而形成新的血管并增加血管通透性；是目前治疗性血管新生中研究最广泛的因子之一，它有两类高亲和力酪氨酸激酶受体：VEGF受体1(fms-like tyrosine kinase，flt-1 )和VEGF受体2(kinase insert domain-containing receptor，KDR )，VEGF 受体可与VEGF 特异性结合，发挥促血管新生作用；VEGF也是目前发现的最重要血管生长因子之一，它可以特异性地促进血管内皮细胞进行有丝分裂，具有诱导新生血管生成的作用[3-4]，在缺血疾病发生发展过程中，机体具有一定的代偿机制，主要表现为血管新生和侧支循环建立[5]，VEGF对其形成过程有着重要作用。MVD值是评价血管生成的指标，MVD值越高说明新生毛细血管越丰富。本实验结果显示，术后3 d及14 d三七组VEGF的表达高于模型组及假手术组，三七组与模型组比较，缺血组织中VEGF有增高趋势(P<0.05)；术后14 d三七组MVD值高于模型组(P<0.05)。

3.2 三七与下肢缺血的关系 中医认为下肢缺血性疾病多因“寒湿、气滞、血瘀、痰浊”等闭阻经络、气血不通、阳气不达而致，其最终病机均为气血凝滞，经络阻塞。因此多数医家治疗本病以活血化瘀法贯穿始终[6]。三七化瘀不伤正，止血不留瘀，效在化瘀止血，活血定痛，故与缺血性疾病有着密切关系。现代研究证明三七能抑制血小板聚集和血浆凝固因子，保护缺血性心肌细胞损伤、抑制血栓形成，降低血脂、血糖、抗炎及抗衰老等方面都有作用[7]。另有研究表明三七总皂苷可显著提高心肌梗死大鼠心肌细胞VEGF、bFGF蛋白表达，促进缺血心肌的血管新生，从而达到保护心肌缺血性损伤的作用[8]。本实验结果显示，三七有促进下肢缺血性病变新生血管形成的作用，其机制可能是VEGF表达增加，从而促进血管生成，但是该药除能增加VEGF的表达，是否也能增加CD34+阳性细胞的比例，通过多条信号通路诱导新生血管产生保护内皮功能，还待进一步研究。

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[3] 陈萌，娄利霞，吴爱明，等.活血益气方及其拆方药物血清对VEGF165转染脐静脉内皮细胞分泌MMP-9，MMP-2的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(2)：156．

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[8] 张金生，何庆勇．三七总皂苷对不同时点心梗大鼠心肌VEGF、bFGF蛋白表达的影响[J]．中华中医药杂志，2009，24(11)：1496．

(本文编辑郭怀印)

山西省卫生厅科研课题(No.201201096)

1.山西省中医药研究院(太原 030012)；2.山西中医学院附属医院

李廷荃，E-mail:shanxiwangyanbin@163.com

R543.5 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．011

1672-1349(2016)04-0371-02

2015-10-18)