高通量测序技术在古DNA上的研究进展

李晓凯，乔 贤，丽 春，范一星，苏 蕊

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000）

高通量测序技术在古DNA上的研究进展

李晓凯1*，乔 贤1*，丽 春2，范一星1，苏 蕊1

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000）

古DNA研究经过30多年的蓬勃发展，尤其是在高通量测序技术广泛应用的历史背景下，在研究动植物的起源、驯化、进化以及系统发育重建等方面起到了重要作用。主要就近年来高通量测序技术在古DNA上的研究进展进行了综述，对古DNA研究存在的问题进行了归纳，并对其未来的发展进行了展望。

高通量测序；古DNA；宏基因组

古DNA（ancient DNA，aDNA）是古代生物遗骸中保留下来的遗传物质，包括古代动植物、古人类等的DNA，是现代科学研究中的一项重要的遗传资源，其获取途径主要是考古挖掘或博物馆收藏的古代动植物或人类的遗体或者残存遗迹，以及须经过打磨、液氮裂解和脱钙等预处理后才能提取出DNA片段的古代动植物化石［1］。自1984年，Higuchi等对保存在博物馆的Quagga（斑驴，1883年灭绝）样本进行了DNA提取，并利用获得的DNA片段成功地构建系统发育树以来，关于古DNA分析在动物研究中的重要作用逐渐被人们所重视，随后掀起了研究古DNA的热潮，为在分子水平上构建灭绝物种与其近亲的亲缘关系研究提供了有价值的参考［2］。对古DNA的研究，有助于了解动植物的起源、进化和驯化过程，为进一步深入研究人类和动植物的迁徙路线、系统进化重建提供了一把钥匙，也有效地填补了现代DNA研究在时间跨度上的不足。此外，古DNA研究还提供了某些已经灭绝生物的形态学和分子遗传资料，为从序列上确定古代材料的系统位置以及为仅用现代DNA建立起来的谱系提供了来自古生物的依据。

近10年来，随着分子生物学和大规模测序技术的快速发展，古DNA研究已经形成了以分子生物学理论和技术为基础，与考古学、人类学及古生物等学科交叉产生的一个新的研究领域。在前人工作的基础上，结合高通量测序技术的优势，研究古DNA也能够突破现有研究资料的束缚，更深一步地研究动植物各种特征形成的遗传基础和遗传变异。该文就高通量测序技术广泛应用于古DNA测序研究方面研究进展进行了综述，并对古DNA的研究历史进行了简单的回顾，对古DNA研究存在的问题归纳和未来发展进行了展望。

1 古DNA研究简史

在高通量测序技术广泛运用之前，科学家们就已经对古DNA进行了20多年的探索研究。我国科学家王贵海、陆传宗早在1981年就对马王堆汉代古墓出土的古尸进行了核酸的分离、鉴定［3］。但古DNA这个名词的首次出现是在《Nature》杂志上关于已经灭绝的Quagga（斑驴）的研究报道［2］。几乎同时，Pääbo也在《Nature》上发表关于埃及木乃伊的研究［4］。这两项研究成果的公布，引起了更多科学家们的关于古DNA研究的热情。

在PCR技术应用之前，参与古DNA研究的科学家主要利用克隆测序技术进行序列测定的研究。生物机体死亡后，因氧化、水解及微生物降解等共同作用导致受损伤DNA克隆效率低下及宿主对克隆过程中的DNA分子进行某些修补或修复作用导致无法完全真实反映古代生物遗传信息。因此，在这段时间内关于古DNA研究报道较少，主要成果有Higuchi等对保存在博物馆的Quagga（斑驴，1883年灭绝）的研究和Pääbo对距今2 400多年的埃及木乃伊的研究，虽然后者在以后的研究中受到了质疑。

随着PCR体外扩增技术应用和化石DNA提取技术的逐渐成熟，极大地弥补了克隆测序中存在问题和丰富了古DNA研究资源，极大地促进了有关古DNA的研究进程，掀起了古DNA研究热潮［5］。这段时期内的重要研究成果有关于琥珀中的白蚁线粒体DNA、象鼻虫DNA的研究、孢子中古细菌DNA以及木兰属化石叶绿体DNA的研究［6-9］。

在PCR反应中，易受到污染的现代DNA优先扩增的影响以及在一次扩增中片段大小限制等原因，在一定程度上也影响了古DNA研究的发展。2005年以后，高通量测序技术的成熟，使得科学家可以对样本中特定区域以外的所有DNA分子的测序研究成为可能。高通量测序技术的应用不仅可以对较小的DNA片段进行测序组装，也扩宽了古DNA的研究内容，如在DNA甲基化完整图谱、蛋白质的分析、核小体图谱和胞嘧啶甲基化水平等方面的研究［10-12］。此外，测序技术的发展也使科学家们可以对更古老的样本进行研究，如对加拿大育空地区冻土层中的70万年前的古马化石进行了测序研究［13］。

关于古DNA的研究并非一帆风顺，因为古DNA的降解作用，在PCR扩增时，会优先选择现代DNA为模板，导致研究过程极易受到现代DNA的污染，因此科学家曾经就古DNA的真实性问题提出了质疑，甚至有科学家认为所有得到的古DNA都有可能是一些污染的PCR产物［14］。如从8 000万年前恐龙骨骼碎片中得到的“古DNA”序列经证实不过是现代人类祖先的DNA，而从2 000万年前木兰叶化石中提取的叶绿体古DNA，经PCR测试后证实是叶片发生感染后的细菌DNA［15-16］。然而这些古DNA研究并非一无是处，DNA被污染的问题也促使他们在挖掘、分类、保管和测序时更加小心和科学处理。随着后来Poinar和Green等科学家分别对Neandertal人的不同片段大小的线粒体DNA研究比对分析，证明了古DNA存在的可靠性，古DNA的研究也迎来了发展的黄金时期［17-18］。因此为了保证古 DNA研究结果的可靠性，Handt和Pääbo等呼吁并建立严格的研究和实验标准，为以后的古DNA提取、实验处理、数据分析等方面提供了学术研究标准［19-20］。 为了最大限度降低DNA受污染的风险以及评估DNA含量，研究人员通过不同分子模式的差异来区分现代、古代的DNA和使用PCR评估环境与内源性DNA的相对丰富度［18-19］。

2 古DNA的测序研究进展

高通量测序技术的发展应用为进一步深入研究古基因组学提供了可能，使得科研人员可以通过对核DNA的测序分析更精确地研究不同物种的基因组受选择作用的遗传基础、物种的复杂进化关系及为分子系统进化分析提供时间标尺，揭示推断物种过去与现在隐藏的复杂关系。2005年，美国科学家首次利用高通量测序方法对一头4万年前洞熊的牙齿进行基因组提取、测序研究，测序结果分析发现，大约仅有6%的DNA是来自洞熊，但研究中获得的27 kb大小核基因组为以后古生物基因组的测序组装研究提供了参考［19］。

高通量测序技术在古基因组学首次研究是关于猛犸象化石的和尼安德特人化石的研究。2006年，Richard等对距今 38 000年已经灭绝的尼安德特人的化石进行测序研究，比对分析发现现代人与尼安德特人分化时间约为50万年前［21］。

2011年，科学家们对木乃伊宏基因组首次利用高通量测序技术进行测序，随后，科学家们利用宏基因组学研究方法对有 215年历史的木乃伊进行测序，发现了肺结核基因组，表明宏基因组技术可以不经过细菌的培养而非常有效的追踪传染病演变和传播，可以进一步了解古代的疾病，有助于预防新型疾病或者过去曾经出现的疾病［18］。

2010年，Kyle等完成了约63%的安德特人基因组草图；随后在2012年，Meyer等利用3万～8万年前的西伯利亚丹尼索亚人（一种灭绝的尼安德上特人近亲）的指骨上提取的长度仅有35个碱基对的DNA碎片进行整合、拼接，在《science》上发表了一个高质量的基因组序列，为进一步研究人类起源进化提供了参考［22-23］。2015年，Qiaomei等通过目的性的大区域区域核DNA富集测序，发现距今约4万年前的欧洲现代人含有6%～9%左右的尼安德特人基因，超出早期关于现代人和现存欧亚大陆人基因组含量（1%～4%）的研究；推测现代人祖先与尼安德特人的基因交流可能不仅仅局限于中东，很可能在之后的欧洲也同样发生过［22，24］。

2013年，Ludovic等利用马腿骨中DNA进行短基因序列组装，获得了70万年前中更新世时期北美洲的冻土地区马的基因图谱，是迄今所测绘的最古老的基因组序列。进化分析发现，马可能是在400万年前由驴演化而来，而普氏野马（przewalski′s horse）约在5万年前由家马中分支出来。比较基因组研究还发现古代马基因组中不含有现代马基因组中与血细胞、繁殖、毛色和肌肉等相关的基因，说明现代马经历了强烈的驯化过程［10］。 2015年Eleftheria等分别对来自44 800年前晚更新世的西伯利亚东北地区和43 000年前弗兰格尔岛地区的猛犸象进行测序研究，群体遗传分析发现在中、晚更新世时猛犸象群体出现瓶颈现象，而弗兰格尔岛猛犸象在末次冰期群体显著下降。比较基因组分析发现，弗兰格尔岛地区猛犸象的遗传多样性较低且有近亲交配现象［25］。

古DNA的研究也可帮助解决一些无头公案和人口失踪案件的侦破，如Parabon纳米实验室和I-dentitas 2家公司目前正在为犯罪调查提供现代基因测序技术，即利用微阵列基因分型技术确定的数十万个单核苷酸多态（SNPs），可以提供眼球、头发颜色和雀斑等各种表型特征信息，该技术的成熟应用将极大促进现场受到严重破坏的刑事案件侦破［26］。

3 研究展望

经过了30多年的历史积累，尤其是在分子生物学、测序技术和生物信息学快速发展的当今社会，古DNA在人类和动植物起源、驯化、系统发育重建等研究方面日显重要。尤其在近10年，测序技术的快速发展极大地促进了古DNA在各领域的研究应用。纳米孔测序法等第3代技术在古DNA的研究运用促使了研究人员可以进行更深入、更广泛的研究探索。如对有70万年历史马的DNA序列的成功测定，对4.3万年前猛犸象化石蛋白质组研究，对尼安德特人和丹尼索亚人的DNA甲基化图谱研究等。随着科学技术的进步，对古DNA的研究内容将更加广泛，也使对古DNA的研究越来越受到重视。对古生物的测序研究限于技术等原因，更古老的DNA测序研究依然是科学领域面对的一个极大的挑战。DNA除杂和测序技术若能得到更进一步的创新，追溯到更久远年代的遗传信息也将成为可能。目前，在古DNA的研究上因片段太小和死后基因组序列的变化等都导致在基因组组装上出现了很大的困难；另外，DNA受到外界的各种污染一直是研究中的主要问题。不同物种基因组测序工作的完成以及不断积累的古DNA测序数据，将进一步解决基因组组装方面的问题。不断完善的挖掘、保存手段、DNA除杂和DNA提取方法、测序手段，也使古DNA研究的可靠性越来越受到肯定，追溯到更久远年代的遗传信息也将成为可能。

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（责任编辑：钱英红）

Research Progress on Application of High Throughput Sequencing Technology in Study of Ancient DNA

LI Xiao-kai1*，QIAO Xian1*，LI Chun2，FAN Yi-xing1，SU Rui1
（1.College of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Inner Mongolia University for the Nationalities，Tongliao 028000，China）

In the past 30 years,the investigation of ancient DNA has been vigorously developed.Under the background that highthroughput sequencing technology is widely employed,the ancient DNA plays an important role in clarifying the mechanism of origin,domestication,evolution and phylogenetic reconstruction of plants and animals.In this paper,the research progress on application of high throughput sequencing technology in investigation of ancient DNA was reviewed,the existing problems in study of ancient DNA were summarized,and the development of ancient DNA study in future was prospected.

high-throughput sequencing；ancient DNA；metagenome

Q91-3；Q78

A文章顺序编号：1672-5190（2016）02-0098-04

2016－01－20

项目来源：国家绒毛用羊产业技术体系项目（nycytx-40-8）；国家自然科学基金青年基金项目（31402052）；内蒙古自然科学博士基金项目（2014BS0313）；内蒙古民族大学科学研究项目（BS308）。

李晓凯（1990—），男，硕士研究生，主要研究方向为动物遗传育种。乔贤（1991—），女，硕士研究生，主要研究方向为动物遗传育种。

*李晓凯、乔贤为并列第一作者。

苏蕊（1980—），女，副教授，博士，主要研究方向为动物遗传育种。