颗粒蛋白前体在皮肤鳞癌A431细胞中的表达及其作用研究

宋颖劼，刘明章，钟华杰，陆群英，戴利成

颗粒蛋白前体在皮肤鳞癌A431细胞中的表达及其作用研究

宋颖劼，刘明章，钟华杰，陆群英，戴利成

目的探讨颗粒蛋白前体（PGRN）在皮肤鳞癌A431细胞中的表达及其对生长转移的调控作用。方法构建PGRN干扰细胞株，通过增殖（CCK-8）实验和侵袭（Trans-well）实验分别研究PGRN在皮肤鳞癌A431细胞的增殖和侵袭中的作用，探讨PGRN在皮肤鳞癌生长及转移中的意义。结果成功构建了PGRN-shRNA-A431细胞株，并通过CCK-8实验和Trans-well实验验证了干扰PGRN后对皮肤鳞癌A431细胞的生长及侵袭具有抑制作用。结论PGRN在皮肤鳞癌A431细胞中表达，并与皮肤鳞癌的发生、发展密切相关。

颗粒蛋白前体；皮肤鳞癌；A431细胞

皮肤癌为临床常见的恶性肿瘤之一，为白种人常见的恶性肿瘤，甚至超过其他恶性肿瘤的总和。流行病学调查表明：由于臭氧层的破坏和人们户外活动的增多，皮肤癌的发病率呈逐年上升的趋势，仅在美国每年新诊断皮肤癌患者约130万例[1]，在澳大利亚南部地区，皮肤癌的发病率达650/10万，在美国的高加索人中，皮肤癌的发病率亦高达165/10万[2]。本研究观察颗粒蛋白前体（PGRN）在皮肤鳞癌细胞 A431中的表达及其与皮肤鳞癌细胞增殖和迁移的相关性。现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料细胞培养：人皮肤鳞癌细胞A431，人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清（FBS）、D MEM培养基、0.025%胰蛋白酶、青链霉素和嘌呤霉素均购自美国Gibco公司。

1.2方法A431细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5%CO2的37℃培养箱中培养。

1.2.1shRNA干扰病毒的构建与包装

本实验针对PGRN序列设计shRNA序列克隆至带有 EGFP报告基因的GV248载体进行病毒载体构建。将构建成功的慢病毒表达质粒PGRN-shRNAGV248与其他两种辅助包装原件载体质粒、三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞。293T细胞培养于DMEM培养基中，转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，接种于10 cm细胞培养皿，37℃，5%CO2培养箱内培养。转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。将质粒DNA转染至293T细胞中，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，PBS液洗涤一次，更换为含10%血清的细胞培养基，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48 h，荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达。收集转染后48 h的293T细胞上清液，将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，－80℃长期保存。

1.2.2shRNA干扰PGRN稳转细胞系的构建PGRN抗体及GAPDH抗体均购自美国SantaCruze公司，稳转细胞株按照说明书操作。PGRN及GAPDH抗体 A431细胞培养于含 10%FBS的DMEM 培养液中至对数生长期，用0.025%的胰蛋白酶消化，按5×105个细胞/ml接种于12孔板中，培养过夜后按照MOI 20感染A431细胞，同时设立对照组，48 h后，将培养基换成含5g/ml嘌呤霉素的新鲜培养基进行细胞筛选，以后隔天更换含5g/ml嘌呤霉素的新鲜培养基，10～12 d后，0.025%的胰蛋白酶消化细胞，将其按1个细胞/100l培养液接种于96孔板，1周后，挑选单克隆株，继续扩大培养。Western Blot鉴定阳性克隆株，并挑选生长良好的单克隆株冻存及用于后续实验。

1.2.3细胞增殖实验A431细胞培养于含10%FBS的DMEM培养液中，用0.025%的胰蛋白酶分别消化对数生长期的 PGRN-shRNA-A431细胞、ControlshRNA-A431细胞及A431细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为100 l，各组细胞分别做6个复孔。将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中，48h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）10l，在37℃细胞培养箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 l DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。

1.2.4细胞侵袭实验A431细胞培养于含10%FBS的DMEM培养液中，按照24孔比色法检测细胞侵袭能力试剂盒[QCMTM24-Well Colorimetric Cell InvasionAssayKit（CHEMICON）]的说明书要求进行操作，用0.025%的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PGRN-shRNA-A431细胞、Control-shRNA-A431细胞及A431细胞，将细胞按5×105/ml接种于小室，48h后，对细胞进行染色，在普通倒置显微镜下观察细胞迁移情况，并检测细胞裂解液在560 nm下的吸光值，对其定量。

1.3统计方法采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用-检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PGRN干扰细胞株PGRN-shRNAA431的构建及鉴定通过慢病毒感染及嘌呤霉素筛选，成功得到A431被干扰的稳定细胞株PGRN-shRNA-A431。抽提细胞蛋白后，通过WesternBlot验证了PGRN的表达，PGRN-shRNA-A431细胞株几乎不表达PGRN蛋白（封四彩图3）。

2.2PGRN促进A431细胞的增殖和侵袭

通过CCK-8实验，PGRN-shRNA-A431细胞吸光值（0.325±0.05）与 ControlshRNA-A431细胞（0.768±0.12）和A431细胞（0.785±0.15）比较，其细胞增殖效率发生显著降低（均＜ 0.05），而 ControlshRNA-A431细胞和A431细胞比较，其细胞增殖率差异无统计学意义（＞0.05）。

通过细胞迁移实验，PGRN-shRNAA431细胞吸光值（0.125±0.013）与ControlshRNA-A431细胞（0.232±0.042）和A431细胞（0.257±0.028）比较，其细胞侵袭效率发生显著降低（＜0.05）（封四彩图4），而ControlshRNA-A431细胞和A431细胞比较，其细胞侵袭率差异无统计学意义（＞0.05）。

3　讨论

皮肤癌主要分为3种：基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑色素瘤，其中基底细胞癌最多见，占60%以上，鳞状细胞癌约占30%，平常所说的皮肤癌主要是指这两种[3]。皮肤癌的发病率虽然逐年上什，但目前临床治疗方法仍存在许多弊端，如激光外科虽操作简单，费时少，但其费用高，而且有时不易掌握破坏范围，易导致正常组织损伤和治疗不彻底易复发等；冷冻外科本身虽不会带来疼痛，但解冻后的组织易产生疼痛、肿胀和渗出等炎性反应，形成瘢痕；目前临床常用的40种化疗药物靶向性低且选择性不强，在杀伤大部分肿瘤细胞的同时对正常组织细胞杀伤作用也较大。因此，寻找一种新的防治皮肤癌的方法是广大医学工作者的当务之急。

许多研究发现，大部分器官中都有PGRN基因的表达，包括皮肤组织、胃肠道系统、女性生殖器官和乳腺上皮组织等[4]。研究发现PGRN蛋白在多种肿瘤细胞，如乳腺癌细胞[5]、卵巢癌细胞[6]、肾上腺皮质瘤细胞[7]和前列腺癌细胞[8]中，都有明显的高表达，它在调解肿瘤细胞的生长、增强细胞侵袭能力和促进肿瘤组织血管形成等方面发挥重要作用，提示PGRN可能成为肿瘤治疗的良好靶点。

本研究发现，PGRN在皮肤鳞癌细胞A431中表达显著，因此推测其可能对皮肤鳞癌细胞的生长和侵袭具有重要作用。因此，构建成功了PGRN的干扰病毒，并将此病毒感染A431细胞，从而获得了PGRN干扰的A431稳定表达细胞株，通过该细胞模型研究PGRN在A431生长过程中调控作用。通过细胞增殖实验，笔者发现，PGRN干扰后，A431细胞的生长受到明显的抑制，与未处理A431细胞相比较，其增殖抑制率达到58.6%，而对照病毒处理组与未处理的A431细胞相比较，增殖抑制率无显著差异。而通过细胞侵袭实验，笔者还发现，PGRN干扰后，A431细胞的侵袭能力也发生了显著的降低，与未处理的A431细胞相比较，其侵袭抑制率达到51.4%，而对照病毒处理组与与未处理的A431细胞相比较，侵袭抑制率无显著差异。

PGRN促进肿瘤细胞增殖、调节炎症反应等作用受到细胞内外信号的严密控制。当细胞外因素刺激或细胞本身的生理功能发生变化时，PGRN可通过多条信号传导途径发挥其生理功能。目前，大量研究表明，PGRN主要通过以下几条信号通路发挥作用：（1）SHC和P44/42MAPK参与的胞外调节激酶信号传导途径[7]；（2）PI3K、PKB/AKT和P70s6kinase参与的 PI3K信号传导途径。PGRN主要通过以上两条信号传导途径发挥其促进细胞增殖的功能[8]；PGRN还可以促使粘着斑激酶（FAK）上的酪氨酸磷酸化[9]。FAK主要参与调节整合素以及细胞骨架蛋白的信号通路，因此，PGRN通过活化FAK，从而激活整合素信号传导通路，发挥其促进肿瘤细胞迁移和抵抗失巢凋亡的功能。

目前PGRN在皮肤组织中的研究报道还很少，PGRN在表皮细胞中有表达，在皮肤癌细胞A431中高表达。但是，其具体的作用及调控机制还不是很明确。因此，研究PGRN在皮肤癌细胞生长中的作用，探索其调控细胞生长的机制，对于进一步了解PGRN在皮肤生长发育及皮肤癌生长转移中的作用机制具有重要意义。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.05.052

R365；R75

A

1671-0800(2016)05-0661-02

2016-01-10

（本文编辑：陈志翔）

浙江省湖州市科技局一般项目（2012YS09）

313000，浙江省湖州，湖州市中心医院

宋 颖 劼，Email：songyingjiehz@126.com