SIAH1在乳腺癌中上调Bim的表达诱导乳腺癌细胞凋亡研究

杨志强，温媛媛，李春生

SIAH1在乳腺癌中上调Bim的表达诱导乳腺癌细胞凋亡研究

杨志强，温媛媛，李春生

目的 探讨SIAH1在乳腺癌中的表达及对乳腺癌细胞凋亡的影响。方法 采用逆转录PCR和免疫印迹试验法检测30例乳腺组织与乳腺癌细胞中 SIAH1的表达情况。采用脂质体介导法将 SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1、对照质粒pcDNA3-myc、SIAH1干扰片段SIAH1siRNA1、对照片段controlsiRNA1、BimsiRNA1及对照片段controlsiRNA2转染入乳腺癌细胞系MDA-MB-231后，利用逆转录PCR和免疫印迹试验法检测SIAH1基因在mRNA和蛋白水平的表达情况及对Bim表达的影响，并应用流式细胞仪技术分析检测SIAH1 对 MDA-MB-231细胞凋亡的影响。结果 SIAH1在乳腺癌组织和细胞中低表达。与乳腺癌细胞系 MDAMB-231转染对照质粒组相比，转染pcDNA3-myc-SIAH1后，Bim表达上调，细胞凋亡率增加；干扰SIAH1表达后，Bim表达下调。与乳腺癌细胞系MDA-MB-231转染pcDNA3-myc-SIAH1相比，共转染pcDNA3-myc-SIAH1 和BimsiRNA1后，凋亡率明显减少。结论 过表达SIAH1可通过上调Bim表达来诱导乳腺癌细胞凋亡。

乳腺癌；SIAH1；Bim；细胞凋亡

[Modern Piactical Medicine, 2016,28(6) :713-715,730]

人类有两个高度保守同源的 SINA，SIAH1和SIAH2，两者有77%的同一性，但SIAH1和SIAH2蛋白在N端有显著差别。SIAH1表达在许多正常和肿瘤组织中，发挥诱导细胞凋亡和抑制肿瘤的作用[1]。SIAH1基因在人类肝细胞癌中首先被认为是肿瘤抑制因子[2-3]。研究表明，一些 E3泛素化连接酶如CHFR、SIAH1，与CHIP可调节乳腺癌的发生[4]。另外还有研究发现乳腺癌细胞转染 SIAH1表达质粒后可通过改变细胞的有丝分裂来抑制细胞生长和诱导细胞凋亡[5]。Bim属于Bcl-2家族成员之一，是重要的凋亡调节因子，在许多肿瘤的发展中起重要调节作用。DNA损伤、血清饥饿及紫杉醇等刺激可影响Bim的表达来引起细胞的凋亡[6]。Bim可诱导造血细胞，上皮细胞和神经元等细胞的凋亡[7-8]。

近来有研究表明，SIAH1可激活JNK信号通路来调节细胞的凋亡[9]。另外，一些研究发现JNK通路可通过调控Bim来诱导细胞的凋亡[10]。笔者推测SIAH1调节乳腺癌细胞的凋亡可能是通过影响Bim的表达来实现的，报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞培养 乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDAMB-435S与 MCF-7，以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A。3种细胞均为贴壁生长的细胞系。细胞接种在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的DMEM培养液中，在37℃，5%CO2环境下培养。

1.2 主要试剂及方法 DMEM培养液和胎牛血清购自美国GIBCO公司，山羊抗人SIAH1及购于SantaCruz公司，兔抗人Bim购于cellsignal公司，抗 -actin购于北京中杉金桥生物技术有限公司，Lipofect2000购于Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。PCR引物合成与测序委托大连Takara公司进行。采用逆转录PCR（RT-PCR）和免疫印迹试验（Westernblot）法检测30例乳腺组织与乳腺癌细胞中SIAH1的表达情况。

1.3 siRNA干扰和细胞转染 根据siRNA设计原则，选取人SIAH1 mRNA和Bim mRNA中的特异性核苷酸片段为靶目标，应用Ambion公司在线siRNA设计软件设计SIAH1和Bim的RNAi序列，经Blast确定所选靶向的基因是特异的，序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。实验分3组：空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组，每个实验均重复3次，转染具体步骤按Lipofect 2000试剂说明书进行。SIAH1siRNA序列：1：5’-AACTCCTGCCTCCTTATGTATTT-3’，2：5’-GAUAGGAACACGCAAGCAA-3’，3：5’-GUUGCAUGUAGUAACACUA-3’。非特异性siRNA1（control siRNA 1）序列：5’-AAGAGCCGTCAGACTGCTACA-3’。Bim siRNA序列：1：5’-ACCGAGAAGGUAGACAAUU-3’，2：5’-CUACCUCCCUACAGACAGA-3’，3：5’-CUACCUCCCUACAGACAG A-3’。非特异性siRNA2（controlsiRNA2）序列：5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’。鉴于转染效率和稳定性，笔者选择SIAH1siRNA1和BimsiRNA1进行实验。SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1和对照质粒pcDNA3-myc由Matsuzawa Shu-ichi（Burnham Institute，LaJolla，California，USA）教授惠赠。具体转染步骤按脂质体LipofectamineTM试剂说明书进行。以未转染的细胞和转染空载体细胞作为对照。

1.4 Western blot4℃下取1～2g标本，加约5倍湿重的裂解缓冲液，粉碎匀浆后，4℃静置24 h，低温高速离心(4℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清即为总蛋白。经电泳、转印，5%正常小牛血清封闭，抗SIAH1(1︰400)和抗 -actin(1︰500)4℃下孵育，过夜；于二抗室温下孵育2h。ECL显色，X线胶片曝光成像，经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像。每组结果均为相同条件下重复3次。

1.5 RT-PCR 采用 TrizolTM 试剂提取细胞的总RNA，利用RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0试剂盒进行反转录。PCR引物为：SIAH1：上游：5’-TCCAACAATGACTTGGC GAGT-3’，下游：5’-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG-3’；Bim：上游：5’-CTGCAGATATGCGCCCAGAGAT-3’，下游：5'-CACCAGGCGGACAATGTAACG-3’；-actin：上游：5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。PCR产物长度为253bp （SIAH1），167bp（Bim）与513bp（-actin）。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，成像分析。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，以1×104/ml的密度接种于细胞培养瓶内，置于37℃CO2孵箱中培养。培养24h后，换无血清的DMEM培养液同步化24h。72h后用0.25%胰蛋白酶消化、离心，收集细胞，预冷PBS洗2次，1000r/min离心8min，弃上清，加PBS600l轻轻吹匀细胞，加RNA酶（终浓度50g/ml）处理30min，37℃。然后加入PI处理15 min，4℃。用流式细胞仪测定细胞周期。sub-G1期细胞代表凋亡[11]。

2 结果

2.1 SIAH1的表达 在30对样本中，27例乳腺癌组织中SIAH1蛋白表达低于配对的癌旁组织；26例乳腺癌组织中SIAH1mRNA表达低于配对的癌旁组织（封二彩图4A）。SIAH1蛋白和mRNA在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7与MDA-MB-435S中表达低于乳腺正常上皮细胞系MCF-10A（封二彩图4B）。

2.2 乳腺癌细胞中SIAH1与Bim表达的关系 对MDA-MB-231细胞转染 pcDNA3-myc-SIAH1后发现，SIAH1与Bim表达显著上调，同时，转染SIAH1siR-NA后观察到SIAH1与Bim表达明显下调（封二彩图5A）。与细胞转染pcDNA3-myc-SIAH1相比，细胞共转染pcDNA3-myc-SIAH1与BimsiRNA1后Bim表达下降。与转染BimsiRNA1相比，细胞共转染pcDNA3-myc-SIAH1与Bim siRNA 1后Bim表达上调（封二彩图5B）。

2.3 乳腺癌细胞凋亡情况 与转染空载体pcDNA3 （1.11±0.21）%、control siRNA 1（1.14±0.27）%或未转染细胞（untreated）（1.02±0.26）%相比，MDA-MB-231细胞转染pcDNA3-myc-SIAH1（18.06±3.35）%后细胞凋亡率明显增加。MDA-MB-231细胞共转染pcDNA3-myc-SIAH1 和BimsiRNA1（0.96±0.18）%后，凋亡率与转染controlsiRNA2（1.04±0.19）%、BimsiRNA1（1.12±0.23）%或未转染细胞（untreated）（1.02±0.26）%差异无统计学意义（＞0.05），与单独转染pcDNA3-myc-SIAH1（18.06±3.35）%相比显著降低（封三彩图1）。

3 讨论

SIAH1基因位于染色体带16q12-q13，这个区域在各种肿瘤中经常缺失[11]，这表明SIAH1可能是一种肿瘤抑制因子。Hiroshi等观察到在Huh7、HepG2细胞中，过表达SIAH1可能通过降解癌蛋白BAG-1，-catenin与PEG10来发挥它的肿瘤抑制作用。在肝癌细胞中，转染外源性的SIAH1于HCC细胞可诱导细胞的凋亡，表明SIAH1在抑制肝癌的形成中起重要作用[6]，在乳腺癌中SIAH1对其细胞凋亡及其机制的研究尚未报道。

本研究中，笔者采用Westernblot和RT-PCR结果发现，SIAH1蛋白和mRNA在乳腺癌组织和细胞中低表达，这与笔者已报道的免疫组化结果相一致，即 SIAH1蛋白在乳腺正常组织表达高于乳腺浸润性导管癌。这些结果均提示 SIAH1表达减少或缺失在乳腺癌的癌变过程中起重要作用，这一结果在肝癌细胞中也得到了证实[12]。

为了进一步探讨SIAH1对乳腺癌细胞生物学行为的影响和明确SIAH1与Bim的相互关系，笔者转染了SIAH1表达质粒，发现过表达SIAH1可上调Bim的表达。另外笔者干扰SIAH1表达后发现与之相反的实验结果。这与Roperch等[13]报道的结果一致。

SIAH1表达增加是通过什么具体机制来诱导乳腺癌细胞凋亡？一些研究表明，p53可使SIAH1转录增加，同时SIAH1在p53调节的细胞凋亡中发挥重要作用[13]。另外，SIAH1可通过降解一些癌蛋白BAG1来促进细胞凋亡[14]。有报道称，SIAH1可通过调节细胞有丝分裂过程来导致细胞凋亡[14]。然而，最近有研究发现，SIAH1可通过激活JNK信号通路来诱导细胞凋亡[9]。许多研究表明JNK信号通路可调节Bim的表达来诱导细胞凋亡[15-16]，所以，笔者推测，Bim 在SIAH1调节的乳腺癌细胞凋亡中发挥一定作用。

为了进一步明确Bim在SIAH1诱导的乳腺癌细胞凋亡中的作用，笔者共转染了SIAH1表达质粒和Bim小干扰片段，发现过表达SIAH1诱导的乳腺癌细胞凋亡被Bim siRNA抑制了，这一发现更加验证了过表达SIAH1导致的细胞凋亡是通过调节Bim的表达来实现的。

综上所述，SIAH1在乳腺癌组织和细胞中表达降低，SIAH1通过调节Bim的表达来诱导乳腺癌细胞凋亡。这些结果提示，SIAH1表达减少或缺失在乳腺癌的癌变过程中起重要作用，且可能依赖Bim来发挥作用。

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SIAH1 induces apoptosis of breast cancer cells by up-regulating the level of Bim

YANG Zhiqiang, WEN Yuanyuan, LI Chunsheng (Wenzhou Meoical University, Wenzhou City 325035, Zhgiang Forvince, China)

Objective To investigate the expression of SIAH1 in breast carcinoma and its effect on the induction of breast carcinoma apoptosis. Methods The expression of SIAH1 mRNA and protein were examined in breast cancer tissues and cell lines by RT-PCR and western blot. MDA-MB-231 cells were transfected with pcDNA3-myc-SIAH1, pcDNA3-myc, SIAH1 siRNA1, control siRNA1, Bim siRNA1 or control siRNA2 by using Lipofectamine 2000. The expression of SIAH1 and Bim were detected by RT-PCR and Western blot. SIAH1-inducing apoptosis of breast carcinoma was detected by Flow cytometry assay. Results SIAH1 mRNA and protein expression were significantly lower in breast cancer tissues and cell lines. Compared with the control and the cells transfected with the pcDNA3-myc, the level of SIAH1 and Bim were increased in the cells transfected with the pcDNA3-myc-SIAH1. And the apoptosis percentage was also increased. On the contrary, the level of SIAH1 and Bim were decreased in the cells transfected with the SIAH1 siRNA1. Conclusions Overexpression of SIAH1 can induce apoptosis of breast carcinoma by up-regulating the level of Bim.

Breast carcinoma; SIAH1; Bim; Apoptosis

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.06.006

R737.9

A

1671-0800(2016)06-0713-04

2015-12-10

（本文编辑：钟美春）

国家自然科学基金（青年科学基金项目）（81201853）；浙江省自然科学基金项目（Y2110620、Y2111209）

316000浙江省舟山，舟山医院（杨志强、李春生）；温州医科大学（温媛媛）

温媛媛，Email:wenyuanyuan1022@sina.cn