布鲁氏菌不同菌株间差异蛋白的研究进展*

豆晓霞，刘 洋，刘 升，王红红，李 敏，荆明龙，陈创夫，张 辉*

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000）

布鲁氏菌不同菌株间差异蛋白的研究进展*

豆晓霞，刘 洋，刘 升，王红红，李 敏，荆明龙，陈创夫，张 辉*

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000）

布鲁氏菌病是一种全球流行性的人兽共患病，严重威胁着人类的健康及畜牧业的发展。随着蛋白质组学研究技术的快速发展，通过不同布鲁氏菌菌株间蛋白质组学研究，分析羊种布鲁氏菌强毒株与疫苗株间的差异蛋白，牛种布鲁氏菌与羊种布鲁氏菌间的差异蛋白，猪种布鲁氏菌强毒株与疫苗株间的差异蛋白，可为探求布鲁氏菌在致病机制、毒力因子、代谢通路、诊断标志物以及新型疫苗的研制等热点研究方面提供理论依据和解决方法。通过对布鲁氏菌的蛋白质组学研究，以期在布鲁氏菌病诊断防治研究上取得重大突破。

布鲁氏菌；蛋白质组；差异蛋白；双向电泳；质谱

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病，该病呈世界性分布[1]，是目前世界上流行最广、危害最大的人兽共患病之一。布鲁氏菌（Brucella）感染人类、多种家畜和野生动物，它可以引起人的波浪热和慢性关节炎及反刍动物流产和睾丸炎等。1887年布鲁氏菌首次在马耳他地区由Sir David Bruce从布鲁氏菌病引起死亡士兵的脾脏中分离获得，因此，布鲁氏菌病也称为马耳他热或波浪热[2]。布鲁氏菌病在全球170多个国家和地区流行，主要集中于地中海、非洲、拉丁美洲、中东和亚洲的部分地区。我国布鲁氏病主要分布在我国的“三北”地区，如内蒙古、新疆、辽宁、吉林、黑龙江等地。

随着人们对于布鲁氏菌的不断深入研究，根据宿主偏好性和生化表型等，将布鲁氏菌分为6个经典的种：羊种布鲁氏菌（Brucellamelitensis）、牛种布鲁氏菌（Brucella abortus）、猪种布鲁氏菌（Brucella suis）、犬种布鲁氏菌（Brucella canis）、绵羊种布鲁氏菌（Brucella ovis）和沙林鼠种布鲁氏菌（Brucella neotomae）[3-5]。最近又有4种布鲁氏菌被鉴定出来，包括：从海豹分离的鳍脚类布鲁氏菌（Brucella pinnipediae）；从海豚分离的鲸种布鲁氏菌（Brucella ceti）[6]；从红狐、田鼠、土壤中分离的田鼠种布鲁氏菌（Brucella microti）[7-9]；从乳腺移植病人分离的湖浪种布鲁氏菌（Brucella inopinata）[10]。

现阶段限制布鲁氏菌研究的主要问题有：（1）在对动物的布鲁氏菌检疫方面，当前的检测方法无法区分自然感染和接种疫苗的动物；（2）人类预防布鲁氏菌感染没有理想的疫苗，使得人们感染的机率增加。那么寻找布鲁氏菌的疫苗接种和自然感染的差异之处，以及寻求理想的布鲁氏菌的免疫抗原作为候选疫苗成为研究要解决的首要问题。随着蛋白质研究的不断发展，布鲁氏菌比较蛋白质组学研究已经成为解决这些问题的主要手段，例如美国的Vito G.Delvecchio[11-12]分别对比了羊种布鲁氏菌疫苗株Rev 1和强毒株16M的种内差异以及牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌16M的种间差异；国内赵忠鹏[13]、张洪丽[14]、杨艳玲[15]等针对国内的布鲁氏菌不同菌株进行差异蛋白质组学研究。本研究主要针对布鲁氏菌不同菌株之间存在的差异蛋白进行分析，基于布鲁氏菌的不同菌株在致病性、毒力、免疫原性等方面的不同，给予分子依据，为布鲁氏菌病的检疫和疫苗研发起到积极的推动作用。

1 羊种布鲁氏菌强毒株16M与疫苗株M5的差异分析

国内对于布鲁氏菌的比较蛋白质组学研究主要集中在羊种布鲁氏菌强毒株16M与疫苗株M5之间，研究的主要目的在于揭示布鲁氏菌强毒株与疫苗株的具体差异蛋白，为疫苗株的制弱分子机制提供依据。赵忠鹏[13]等通过双向电泳等技术对羊种布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5的蛋白质整体水平进行分析，研究共鉴定13个差异蛋白，代表了8种不同的开放阅读框（ORFs），其差异蛋白的功能涉及能量代谢、应激、物质运输等。其中5个属于热休克蛋白，2个属于物质运输蛋白，6个涉及能量代谢，1个蛋白位点未得到鉴定。这些蛋白包括Dps蛋白、GroE蛋白、Nichel结合胞质蛋白前体、糖结合蛋白等。

张洪丽[14]通过对羊种布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5进行差异蛋白质组学分析，共筛选出53个差异蛋白点，经过质谱鉴定，其中49个蛋白点在数据库中匹配到了有功能意义的蛋白质，共代表了35个有差别的开放式阅读框（ORFs）。在这49个不同的差异点中，在布鲁氏菌疫苗株M5表达上调的蛋白有22个，在布鲁氏菌强毒株16M高表达的有27个。通过质谱分析，得到的49个差异蛋白功能涉及糖的代谢、脂代谢、蛋白的合成以及外膜蛋白、分子伴侣等。其中Dps蛋白、外膜蛋白Omp25、糖结合蛋白在布鲁氏菌强毒株16M中的高表达可能与布鲁氏菌的毒力有关；侵袭蛋白B在布鲁氏菌强毒株16M与疫苗株M5中均有大量的表达，很可能与布鲁氏菌致病性有关；布鲁氏菌疫苗株M5中高表达的外膜蛋白Omp31前体可能与良好的免疫原性有关。

杨艳玲[15]对羊布鲁氏菌强毒株16M和弱毒株M5的膜蛋白进行了差异蛋白质组学研究。结果显示，一共有33个差异蛋白点，经质谱鉴定和生物信息学检索后发现它们代表了26个开放阅读框（ORFs）。其中有22个蛋白在布鲁氏菌强毒株16M上高表达，4个蛋白在疫苗株M5上表达上调，通过生物信息学数据检索以及相关文献数据分析，在强毒株内高表达的蛋白，在布鲁氏菌的能量代谢、脂肪代谢、蛋白质及氨基酸的合成以及细菌外膜多糖的合成等生物过程中发挥着重要作用。同时在M5株中高表达的蛋白是细菌的重要免疫原性蛋白。通过半定量RT-PCR结果也显示了部分蛋白在转录水平上也存在着差异，如WbkC、PurH、Omp10、SueB。这些差异蛋白的发现为我们解释布鲁氏菌的致弱机制提供了线索和依据，同时也获得了一些与毒力和免疫相关的分子。

李向阳等[16]对布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5进行比较蛋白质组学分析，结果显示，2个菌株存在23个差异点，通过质谱分析和生物信息学检索后发现它们代表了20个开放阅读框，这些蛋白分别包括了布鲁氏菌膜蛋白Omp25、侵袭蛋白B、3-酮脂酰-（酰基载体蛋白）还原酶、Dps蛋白、转醛醇酶、ABC胞浆蛋白糖结合蛋白、胞浆蛋白、铁结合胞质蛋白、镍和细胞质蛋白前体、分子伴侣DanK、乙醛、支链α-酮酸还原酶三硫酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、结合GroEL的外膜蛋白Omp31、细胞质环流因子、甲醛脱氢酶蛋白质等。研究表明，有13种蛋白在布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5中表达上调，这些蛋白质的功能涉及糖代谢、物质运输、蛋白合成和分子伴侣等。

2 羊种布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株Rev 1的比较研究

2002年美国的Vito G.DelVecchio等[12]对布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株Rev 1株进行比较蛋白质组学分析，研究显示，2个菌株在代谢方面呈现部分差异化，差异蛋白主要涉及铁代谢、糖运输、脂质代谢、蛋白合成等。首先，研究表明在强毒株16M中特异性表达的蛋白有8个，其中4个差异点经鉴定有特定的功能，如脯氨酸顺反异构酶（peptidylprolyl cis-trans isomerase）蛋白分别在pH值4.0～7.0和pH值4.5～5.5的范围重复检测到有特异性表达。在不同pH范围的胶条中疫苗株Rev 1特异性表达的蛋白点共有15个，4个点通过鉴定有特定的功能，例如有糖结合蛋白、硝酸还原酶等。其次，相比较疫苗株Rev 1，在16M中高量表达的蛋白有45个，这些蛋白包括有Dps蛋白（19.1倍）、外膜蛋白Omp31前体（11.9倍），ATP合成酶（7.7倍）、延伸因子-tu（13.1倍）、镍结合周质蛋白前体（4.1倍）等。将强毒株16M做为参考，在疫苗株Rev 1中高量表达的蛋白有40个，例如细菌铁蛋白（12.7倍）、铁调节外膜蛋白B（5.4倍）以及铁结合周质蛋白前体（3.6倍），这些蛋白都涉及细菌的铁代谢，这些蛋白也是铁多种吸收系统的组成部分，说明疫苗株Rev 1是在通过不同的途径来促进铁的吸收代谢。有研究表明，铁离子对于病原微生物进入宿主细胞后保持存活起到重要的作用[17]。

3 牛种布鲁氏菌2308株与羊种布鲁氏菌16M种间差异蛋白分析

Michel Eschenbrenner等[11]采用双向电泳串联基质辅助激光解吸/电离的技术比较了羊种布鲁氏菌16M与牛种布鲁氏菌2308株在实验室相同培养条件下的蛋白质组学差异。他们发现在蛋白质表达种类以及表达的量上都存在很大差异。与羊种布鲁氏菌16M相比较，牛种布鲁氏菌2308株特异性表达有11个与膜运输相关的蛋白，6个跟分泌系统相关的蛋白，6个跟糖代谢相关的蛋白，5个跟应激相关的蛋白，4个跟毒力相关的蛋白，特别是跨膜运输和分泌相关的蛋白。作者通过对2个菌株不同种间的差异蛋白分析认为，由于不同氨基酸的代谢能力可能导致是羊种布鲁氏菌16M与牛种布鲁氏菌2308株宿主偏好性的原因；另外II型分泌系统元件及周质伴侣DsbA蛋白的表达差异也可能导致是羊种布鲁氏菌16M与牛种布鲁氏菌2308株宿主偏好性的原因。

4 猪种布鲁氏菌019株与猪种布鲁氏菌S2疫苗株的差异分析

张科[18]在对布鲁氏菌019株的全基因组分析后，将019株划分为猪种布鲁氏菌，同时又对布鲁氏菌019株和猪种布鲁氏菌S2疫苗株进行蛋白质组学比较分析，发现了两株菌存在18个显著的蛋白差异位点，通过质谱分析，发现这些蛋白位点代表了17个开发阅读框，17个差异蛋白中，其中15个有功能注释，2个被注释为假定蛋白。这些蛋白的功能涉及外膜蛋白、转运相关蛋白、转录和翻译相关蛋白、感应与调控相关蛋白、代谢相关蛋白，以及2个未知功能的蛋白。例如Omp31蛋白、Omp31是绵羊种布鲁氏菌主要的免疫原性蛋白，作者研究发现，相对于猪种布鲁氏菌疫苗株S2，布鲁氏菌019株高表达Omp31可能有助于解释S2较弱的免疫原性，同时这一发现也提示我们布鲁氏菌019株具有良好的免疫原性。其次，APHC蛋白---抗氧化相关蛋白，在019株中高表达。AHPC是已知的布鲁氏菌毒力相关因子之一，它可以抵御来自宿主以及外界自然环境过氧化物的侵袭。APHC蛋白在019株的高表达与019强致病特性相一致，与S2疫苗株毒力减弱也存在一定的相关性。也有研究表明[19]，APHC基因的缺失会导致布鲁氏菌在感染C57BL6J小鼠时，脾脏内CFUs下降。

作者进一步对布鲁氏菌019株和S2株差异点的功能进行分析，发现在17个差异蛋白中，外膜蛋白Omp31、转录延伸因子Tufa和烷基过氧化物酶C是已知的布鲁氏菌毒力相关基因；其次，转录延伸因子Tsf、蛋氨酸溶质结合蛋白YaeC、ABC转运因子、TatC是布鲁氏菌潜在的毒力相关基因；天冬氨酸激酶可能是新的治疗布鲁氏病的药物靶蛋白；延胡索酞乙酞乙酸水解酶FahA可能是新的布鲁氏菌免疫原性蛋白。

5 布鲁氏菌019株与羊种16M株、牛种2308株、绵羊种63/290株的比较分析

为了研究布鲁氏菌019株的蛋白质组学特征，张科[18]利用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选布鲁氏菌019株与羊种16M株、牛种2308株、绵羊种63/290株3种布鲁氏菌的差异蛋白。

iTRAQ定量蛋白质组学的结果显示，布鲁氏菌019株与牛种布鲁氏菌2308株，羊种布鲁氏菌16M株和绵羊种布鲁氏菌63/290株相比较，研究发现，布鲁氏菌019株大量上调核糖体相关蛋白的浓度，这一结果与布鲁氏菌019株生长速度较快一致。另外，布鲁氏菌019株与羊种布鲁氏菌16M比较，还上调表达了氧化磷酸化代谢通路多个蛋白的浓度；布鲁氏菌019株与绵羊种布鲁氏菌63/290株比较，上调了柠檬酸代谢（TCA循环）以及多个氨基酸代谢相关蛋白的浓度；布鲁氏菌019株与牛种布鲁氏菌2308株相比，上调了多种氨基酸代谢相关蛋白的浓度。这些能量代谢相关蛋白和氨基酸代谢相关蛋白浓度可能是在核糖体相关蛋白浓度升高的前提下提高的，并满足布鲁氏菌繁殖过程中对能量和氨基酸等的大量需求。通过比较发现，上调表达核糖体相关蛋白是布鲁氏菌019株最明显的特点，这一特点与其生长速度较快的特征一致；从布鲁氏菌的演化历程上看，放慢生长速度可能是布鲁氏菌适应胞内生存机制的一种表现。

6 牛种布鲁氏强毒株544A和猪种布鲁氏菌疫苗株S2间差异蛋白的比较

张俊敏[20]对牛种布鲁菌强毒株544A和猪种疫苗株S2进行全基因组分析，发现疫苗株S2基因组中存在544A缺失的差异基因片段，进一步分析发现该差异基因参与编码repA-related蛋白。武宁[21]在张俊敏对布鲁氏菌差异基因片段研究的基础上，对6个不同种属布鲁氏菌的全基因组序列对比分析发现，repA-related基因存在于猪种、犬种和沙林鼠种布鲁氏菌中，而牛种、羊种和绵羊种布鲁菌中缺失repA-related基因。通过原核表达repA-related蛋白，建立了以repA-related重组蛋白为抗原的间接ELISA检测方法，能够区分S2疫苗免疫牛与牛种或羊种布鲁菌自然感染牛的鉴别诊断。

7布鲁氏菌种间差异蛋白---Omp31蛋白的研究

Vizcain等[22]在1997年通过PCR-RFLP和Southern-blot杂交技术对Omp31基因组的多态性进行了研究，Southern-blot的结果表明，Omp31存在于除B.Abortus（牛种布鲁氏菌）之外其他所有的布鲁氏菌中。他们还发现，在B.abortus（牛种布鲁氏菌）的染色体上有25 kb的缺失，并且这些缺失的序列包括Omp31和1个基因簇。1992年Baily等[23]首先将PCR方法用于布鲁氏菌的鉴定。他们依据编码布鲁氏菌外膜蛋白31k（Omp31）的基因设计了1对引物B4、B5。Om p31是布鲁氏菌的特异性蛋白，这一对引物有很好的灵敏度、特异性、稳定性，可以从属的水平上鉴别布鲁氏菌。杨星雅[24]证实Omp31可作为种间差异的鉴别诊断蛋白，可以鉴别牛种和非牛种布鲁氏菌。

国外研究已证实，在目前所出现的致弱菌苗中Omp31基因缺失株均不改变亲本株的免疫保护作用[25]，Omp31被认为是目前最适合的基因缺失标记疫苗之一，若将Omp31与其他免疫原性蛋白联合用于血清学诊断中，可以将疫苗接种和自然感染动物区分开来[26]。

8 讨论

蛋白质组一词最早是由澳大利亚Macqurie大学的Wilkins提出的，是指一个细胞或组织表达的全部蛋白质，研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科则被称之为蛋白质组学。随着双向电泳技术以及蛋白质谱鉴定技术的成熟，并与生物信息学的结合应用为蛋白质组学的研究提供了高通量快速鉴定蛋白的技术平台，其中差异蛋白质组学又称比较蛋白质组学，研究重点在于2个样本之间的差异蛋白。对布鲁氏菌不同菌株之间差异蛋白质的比较有利于发现强毒株和弱毒株之间的差异蛋白点，为探讨布鲁氏菌的致病机理、疾病诊断和防治、新型疫苗的研制等提供重要的理论依据和实际解决途径。顾超慧等[27]从蛋白质组学在布鲁氏菌研究中的3个方面的应用，包括布鲁氏菌的致病机制、代谢通路及新型疫苗研究应用展开探讨。

当前对于布鲁氏菌不同菌株的差异蛋白的研究意义主要在于以下几个方面：第一，通过布鲁氏菌的强弱毒株的差异蛋白的比较，从蛋白水平寻找布鲁氏菌的毒力蛋白和致病因子。例如，张洪丽对布鲁氏菌16M与M5的强弱毒株的蛋白质组学比较，研究发现差异蛋白Omp25、糖结合蛋白与布鲁氏菌的毒力相关，侵袭蛋白B可能与布鲁氏菌的致病性有关；李向阳等研究发现与布鲁氏菌毒力和致病性相关的差异蛋白Omp25及侵袭蛋白B等；张科对在019株与疫苗株S2比较蛋白质组学研究，发现外膜蛋白Omp31、转录延伸因子Tufa、烷基过氧化物酶C是已知的布鲁氏菌毒力相关基因，转录延伸因子Tsf、蛋氨酸溶质结合蛋白YaeC、ABC转运子、TatC是布鲁氏菌潜在的毒力相关基因；Michel Eschenbrenner等[11]通过布鲁氏菌2308株与16M株比较，发现布鲁氏菌2308株有4个与毒力相关的蛋白。其次，也有多个研究证实在布鲁氏菌疫苗株中低表达的蛋白也与毒力及致病性相关。这些研究结果证明，通过蛋白质组学可以寻找到布鲁氏菌的多个毒力相关的蛋白，通过这些蛋白来进一步研究布鲁氏菌的毒力及致病性。那么通过在疫苗株中低表达的蛋白，可以进一步解释疫苗株的制弱分子机制，为布鲁氏菌疫苗的研制提供一些新的研究依据。

研究布鲁氏菌不同菌株的差异蛋白的第二个意义在于发现野毒株与疫苗株的特异性表达的差异蛋白，用以研究如何区分布鲁氏菌的自然感染与疫苗感染。通过布鲁氏菌强毒株如16M株和疫苗株M5差异蛋白对比研究，找到在16M中或者M5中特异性表达的蛋白，以此蛋白为鉴别诊断抗原，用以区分羊种布鲁氏菌病的自然感染和疫苗感染。美国的Vito G.DelVecchio等[12]对强毒株16M和疫苗株Rev 1株进行比较发现，强毒株16M中特异性表达的有8个蛋白，疫苗株Rev 1特异性表达的共有15个蛋白，这些差异蛋白都可以作为鉴别诊断抗原的候选抗原。但是，目前对这些差异蛋白的研究进展较少，国内就16M与M5的区别感染的问题仍然是亟待解决的问题。

关于差异蛋白研究的热点在于布鲁氏菌疫苗的研制，至今尚未有国际认可的用于人的布鲁氏病疫苗，所以说关于布鲁氏菌病的防治问题仍然是无法突破的瓶颈。有研究发现，外膜蛋白Omp25在布鲁氏菌强毒株16M中有高通量表达，布鲁氏菌侵入巨噬细胞后，其表面Omp25的表达抑制巨噬细胞TNF -α的产生[28]，布鲁氏菌Omp25很有可能与位于巨噬细胞的受体作用，通过对TNF-α分泌途径的修改，进行负调节。也有研究证实，通过删除Omp25基因可能影响布鲁氏菌的毒力[29]，Omp25可能作为有效的疫苗的候选抗原。其次，外膜蛋白Omp31前体在布鲁氏菌疫苗株M5中高表达。Omp31具有良好的免疫原性，是目前免疫保护性分子的研究热点[30]，近年来已经有很多研究重组Omp31用于制备布鲁氏菌DNA疫苗。

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2016-08-17

国家国际科技合作专项，项目编号：2015DFR31110。

*通讯作者：张辉（1978-），男，汉族，教授，从事传染病诊断与致病机制的研究。E-mail：allanzhh@yahoo.com。