香蕉组培苗生产的污染控制问题

唐珊

（湛江农垦科学研究所，广东 湛江 524086）

香蕉组培苗生产的污染控制问题

唐珊

（湛江农垦科学研究所，广东 湛江 524086）

针对香蕉组培苗工厂化生产过程中的污染原因进行初步分析，并总结香蕉组培苗培养工作经验，通过分析与探讨给出相应的预防和控制污染的解决方法，从而降低生产成本，提高香蕉组培苗的质量和生产效益，加快香蕉产业化的发展。

香蕉；组培；工厂化生产；污染

香蕉组培苗虽然早已实现工厂化生产，技术也日趋成熟，但在生产环节中最突出的问题还是微生物污染，这是制约香蕉组培苗大规模生产的主要原因之一。在接种或培养过程中常常因为各种原因直接或间接地导致组培苗很容易发生细菌性或真菌性污染，且污染率常常大于15%，严重时还能引起大量组培苗黄化甚至死亡，特别是在材料稀少、珍贵时，因污染而导致损失尤为可惜。污染会给组培工作带来很大影响和一定的经济损失，这将导致香蕉组培苗生产成本的提高。然而，在香蕉组培苗工厂化生产过程中引起污染的原因有多种。笔者以自身的工作经验，对香蕉组培苗工厂化生产过程中可能引起污染原因，以及如何控制污染总结如下。

1 引起污染的原因

1.1 培养基污染

培养基污染主要是由于培养基灭菌不充分而导致，根据微生物污染源分类，可分为细菌性污染和真菌性污染，未充分灭菌培养基中的细菌芽孢和真菌孢子是引起细菌性污染和真菌性污染的主要根源，通常芽孢和孢子的耐热性均比营养细胞和菌丝体强，在正常高温蒸汽灭菌过程中，营养细胞和菌丝体往往先于芽孢和孢子被杀死，而当高温蒸汽灭菌锅的温度或压力不足时，通常未能将芽孢和孢子完全杀灭，从而导致培养基被污染。由于培养基灭菌不彻底而导致污染的问题，一般要将培养基放置2～3 d时间才能易于观察，然而在组培苗工厂化生产过程中，由于在保证工作效率的原因基本上不会将培养基放置2～3 d再用，因此在接种材料前很难被发现［1］。在鉴别污染是否是由于培养基灭菌不彻底而导致时，可将放置2～3 d的培养基在光照良好的环境下肉眼观察，一般未彻底灭菌的培养基其内部会产生污染，由细菌芽孢发育形成营养细胞并大量繁殖会在培养基内部呈现白色絮状菌团，由孢子发芽生长形成大量菌丝体会覆盖培养基表面。

在组培苗工厂化生产培养基灭菌环节，主要采用高温高压蒸汽灭菌设备对培养基进行灭菌，而通常采用罐头瓶作为培养基装载容器，一次灭菌的数量较多，每锅装载瓶数的多少，每瓶灌装培养基体积的多少，培养基中固体颗粒的存在，培养基成分，灭菌锅在工作过程中冷空气的排放情况，灭菌锅的工作温度和压力等因素，都将直接或间接影响培养基的灭菌效果。因此，在培养基灭菌过程中，在提高工作效率、降低生产成本、降低营养流失的同时，必须保证彻底灭菌。

1.2 工作环境污染

在香蕉组培苗工厂化生产过程中，因工作环境所引起的污染造成的损失占了很大一部分，是生产环节中不能忽视的部分。工作环境包括外部环境和室内环境，外部环境即组培生产车间所处的环境和地理位置，处于环境卫生地区，周围没有垃圾场、产生烟尘的工厂等都能大大降低因外部环境而造成的污染；组培生产车间所建的地理位置也很关键，南方、沿海地区的高温高湿环境比西北、内陆地区更加适宜微生物生长繁殖，市区环境污染比乡下环境污染更严重。因此，在选址建立组培工厂时，外部环境显得尤为重要。相比于外部环境，室内环境好坏将直接影响香蕉组培苗工厂化生产的运作，室内环境主要包括培养室、接种室、缓冲间、预处理室、培养基配制车间、清洗车间和灭菌车间等车间环境，各车间都应尽量保持干净卫生，在接种室和培养室还应注意降低空气湿度，适当控制室内温度，及时清理污染和定时消毒杀菌；在培养基配制车间和清洗车间，应及时清理台面、地板、量取药品用具、培养瓶等可能残留营养物质的地方，以免引起微生物的大量滋生。由工作环境所引起的污染也是香蕉组培苗工厂化生产污染中最难控制的。因此，在生产过程中必须严格管理，方可最大程度地降低此类污染。

1.3 接种材料污染

香蕉组培苗工厂化生产过程中，外植体材料消毒不彻底也是造成重大污染的原因之一，外植体材料处理的好坏直接关系到整个香蕉组培苗工厂化生产的运作，也直接影响到组培苗的质量和产量。而香蕉组培苗生产的外植体主要是蕉头部分，由于蕉头在地面或地下，所带的微生物较多，在消毒过程中也较难于完全杀死所有携带的微生物。因此，在蕉头预处理时，应尽可能地去除地下部分和外围部分，以便于后面的消毒杀菌工作，最大限度降低蕉头的污染。转接材料污染主要是在挑拣材料时，误将难于观察辨认或含有内生菌的污染材料分拣到接种室进行转接而导致污染，甚至交叉感染［2］。

1.4 操作不当污染

接种工作人员因操作不当或不规范所造成的污染是香蕉组培苗生产环节中较易控制的，这方面的污染源包括接种工作人员自身携带微生物，接种器具消毒不彻底，接种时处于超净工作台边缘或角落操作，超净工作台接种前未清理台面并消毒，超净工作台内堆积的培养瓶过多，未经处理的培养瓶直接置于工作台内，经常在培养基或材料的上方操作，接种工具的使用不当，使用存放时间过长的灭过菌的接种工具等不规范操作［3］。通过加强生产管理，提高接种工作人员的基本操作技能和污染意识，可将此类污染控制在最低水平。

2 香蕉组培苗污染的预防与控制

2.1 香蕉组培苗蕉头的消毒及原种芽的培育

笔者反复使用了多种接种方法进行试验，认为蕉头的污染控制好坏，完全决定于接种工作人员，认真做好接种前的准备工作，先把香蕉头用自来水冲洗干净，剥去外层苞片并切成2 cm×2 cm大小的圆锥体［4，5］，再用75%酒精浸泡30 s，倒掉酒精，加入0.1%升汞溶液浸泡10～15 min，在消毒过程中要搅拌3～5次，使附着在材料上的气泡或其他物质得以及时清除而达到充分灭菌的目的。达到设定的灭菌时间后，先将升汞溶液倒入收集瓶，用无菌水清洗外植体材料5次，每次清洗不低于3 min，在无菌碟子上剥除一层叶鞘，并纵切成大小均等的4块，接入香蕉诱导培养基中培养，每瓶接种一块外植体，笔者通过这种方法诱导蕉头的发芽率高达95%以上，污染率在5%以内。

2.2 香蕉组培苗分化苗的污染控制

接种工作人员在摆放材料进超净工作台之前，首先要辨别香蕉培养瓶内是否有细菌和真菌污染，在确保材料无菌的基础上才可摆入超净工作台内，如果不认真细致地检查香蕉培养瓶内是否已被污染，将会导致细菌、真菌的交叉感染，造成更大的污染。在操作过程中要正确摆放所需工具（镊子、刀、碟子）的位置，要将使用过的和经灭菌未使用过的工具分开放置，在使用接种工具前要对其进行大范围的灭菌，由此方可在最大程度上降低污染的可能。

2.3 香蕉组培苗接种的污染控制

在接种室外最好设立一间缓冲间，主要起到接种室连接到其他工作间或走道的过渡作用，接种室的门窗最好设有双层，以防灰尘和微生物。接种室内应装备紫外灯或经常喷洒杀菌剂，以抑制过多微生物生长，缓冲间与接种室之间要设立活动门，工作人员在进入接种室之前在缓冲间内须更换衣服、鞋帽和口罩才能进入接种室，进入接种室后应随手关上活动门。在接种室内尽量不让非工作人员进入，工作人员进入后也不可过多走动或在里面嬉戏打闹，更不允许在里面吃东西、抽烟，以防污染接种室内部环境。在正式工作之前应将接种室内紫外灯和超净工作台的紫外灯提前打开，紫外线照射时间不低于20 min，待紫外灯工作完后方可进入进行接种操作。接种完成后，应将接种室清扫干净，及时清洗换下的衣服、鞋帽、口罩等，并定期进行消毒处理，接种室最好能保持恒定的舒适温度，这样一是有利于提高工作人员的工作效率，二是可使从培养室内取出的植物材料不会因温度变化过大而影响生长。

2.4 香蕉组培苗培植阶段的污染控制

培养室最重要的是要保持无菌、恒温、低湿、无尘且空气流通。温度应维持在（25±2）℃，相对湿度应在30%～40%。整个培养室内还应装有一个或多个紫外灯或臭氧发生器，以便能定时对整个培养间进行杀菌处理，特别是在夏天潮湿，阴雨季节，最好每天在晚上用紫外灯杀菌30 min以上或臭氧发生器工作90 min。培养室内的地面、墙壁、培养架及所有器物的表面都应常清洗、擦拭以防过多灰尘和微生物滋生，进入培养室最好穿戴干净拖鞋或穿一次性塑料鞋套，非工作人员最好少进培养室。

2.5 香蕉组培苗培养基污染的控制

对于香蕉组培苗来说，培养基是香蕉组织培养中的“血液”。如果培养基消毒不彻底，通常会造成很大的污染。所以，在培养基灭菌时，必须严格控制好消毒的时间。当高温灭菌锅上的压力表指针达到0.05 MPa时，关上排气阀继续加热，当指针又升到0.05 MPa时再断加热源，将灭菌锅的冷空气彻底排尽，关上放气阀，继续加热直至压力表指针在0.10～0.15 MPa，温度表为121℃，维持20 min。停止加热，使温度慢慢下降，直到0.05 MPa时慢慢打开气阀，使压力回复到0.00 MPa，打开锅盖，取出培养基。

2.6 香蕉组培苗生产的污染控制管理

香蕉组培苗的污染情况，最终会在培养阶段观察发现，可根据培养阶段香蕉组培苗的污染发生特征、程度，从而判断污染是由哪个生产环节的控制不力或出错所引起，如发现污染菌类是由香蕉芽周围长出的，可判断接种材料本身带菌及在接种时发生的交叉感染引起，应从挑拣无菌材料和保证接种工具不带菌入手解决此类污染问题；又如在培养基础上发现很多霉菌，且发生比例，程度较大，既可判断可能是超净台滤菌功能不佳或是接种、培养环境不卫生引起，须对超净滤菌性能进行测试，培养环境消毒。

总之，要做好香蕉组培苗的污染控制工作，须建立相应的管理制度和制定相关的技术规程，使每个员工都认识和重视污染问题，并懂得防止、控制污染的技术要领，以及对员工防控污染效果进行考核，这样才能使污染降至最低限度，确保香蕉组培苗生产成本最低。

［1］廖俊杰.草莓组培苗工厂化生产中控制污染的措施［J］.中国南方果树，2006（4）：55-56.

［2］张燕.组培苗污染原因分析［J］.中国花卉园艺，2007（2）：45.

［3］祁恒佐.如何做好组织培养生产过程中污染防止工作［J］.现代企业文化，2009（20）：102-103.

［4］单芹丽，赵辉，张付斗.香蕉组培苗的生产技术［J］.北方园艺，2009（6）：79-81.

［5］林贵美.香蕉组培苗的研究与推广［J］.中国热带农业，2005（6）：24-27.

S668.1

A

1674-7909（2016）14-81-3