貉肉中金刚烷胺残留的检测方法

文│李宏娟 张嘉楠 曹秀梅 林艳青 杜顺丰（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心）

貉肉中金刚烷胺残留的检测方法

文│李宏娟 张嘉楠 曹秀梅 林艳青 杜顺丰（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心）

项目名称：河北省秦皇岛市科技局项目（项目编号为：201502A 049）

金刚烷胺又叫三环癸胺、三环葵胺、盐酸金刚烷胺，是国际医学界公认的对流感病毒有抑制作用的抗病毒药物，我国从20世纪90年代末开始在兽医临床上用于动物病毒病的预防和治疗，但是金刚烷胺作为抗病毒药用于兽医临床缺乏科学规范、安全有效的实验数据。

金刚烷胺用于治疗流感能使流感病毒发生变异，并使疫情进一步蔓延，造成抗金刚烷胺病毒的流行，对公共卫生安全造成极大威胁。同时，金刚烷胺比较明显的副作用是用药后产生呕吐以及神经症状，而且其在体内降解代谢的量极微。若长期食用残留量高或被此类药物污染的食品，会在人体积累，导致蓄积中毒，对中枢神经系统造成不良影响。因此，2005年农业部第560号公告和农医发[2005]33号文，规定禁止金刚烷胺等抗病毒兽药生产、经营和使用。

河北省秦皇岛市昌黎县被誉为“中国养貉之乡”，每年貉出栏量可达1100万只。貉的用途一直以毛皮为主，貉胴体现多被废弃或加工成人工饲料。据李时珍《本草纲目》记载：“貉肉甘温无毒，主治元脏虚涝及女子疲惫。”据报道，貉肉营养成分比较高，蛋白含量高于福建猪肉，脂肪低于北京猪、牛、羊肉，胆固醇含量低于猪肉、羊肉和兔肉，蛋白生物价E/T比值接近于牛肉，有很高的食用价值。所以对貉肉的可食性加以开发利用，不仅可以增加肉食来源，而且还可以增加养貉业的收入，促进养貉业的发展。

建立貉肉中金刚烷胺残留检测方法，对有效监控该药在貉的养殖中的应用、推广貉肉食用的食品安全性具有重要意义。目前动物源性食品中金刚烷胺的残留检测，国内外尚无法定检测标准。本文采用甲醇-三氯乙酸提取、MCX小柱净化，BEH C18色谱柱分离后，用超高效液相色谱-串联质谱仪对金刚烷胺进行检测。该方法快速、科学、灵敏、可靠，用于实际样品的检测，结果满意。

一、实验部分

1.仪器与试剂。UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司），高速冷冻离心机，氮空吹扫描仪，Oasis MCX固相萃取小柱（3毫升/6毫克），甲醇、甲酸、乙腈（色谱级，进口），异丙醇，三氯乙酸，乙腈，浓氨水，盐酸金刚烷胺对照品（中国兽医药品监察所）。

2.标准溶液的配制。标准储备液：准确称取盐酸金刚烷胺0.005克于50毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度为100微克/毫升的标准储备液，于4℃下避光储存3个月。

标准中间液：精密吸取上述储备液0.5毫升于50毫升容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成质量浓度为1.0微克/毫升的标准工作液，于4℃下避光储存1个月。

3.样品提取和净化。提取：称取2.0克均质貉肉样品于50毫升离心管中，加入10毫升1%三氯乙酸-甲醇（1∶1，v/v）提取液，充分涡旋混匀1分钟，4℃下10000转/分钟离心10分钟；转移上清液至新的50毫升离心管，加入10毫升正己烷，混匀，10000 转/分钟离心10分钟，除去上层，取下层5毫升净化。

净化：MCX小柱分别用3毫升甲醇、3毫升水活化；5毫升样品过柱；3毫升2%甲酸水、3毫升100%甲醇淋洗，抽干；3毫升5%氨化甲醇∶异丙醇（4∶1）洗脱。收集洗脱液，45℃水浴氮气吹干。1毫升0.1%甲酸水∶乙腈（9∶1）溶解定容，0.22微米滤膜过滤，滤液供UPLC-MS-MS分析。

4.色谱条件。色谱柱：UPLC BEH C18色谱柱（100×2.1毫米，1.7微米，美国Waters公司）。

流动相A：乙腈；流动相B： 0.1%甲酸水溶液；流速：0.3毫升/分钟；柱温：40℃；进样量：5微升；运行时间：6分钟。梯度洗脱见表1。

5.质谱条件。电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：3.5千伏；雾化气温度：400℃；驻留时间（Dwell time）：0.161秒；监测离子对、锥孔电压（Cone）和碰撞能量（Collision）等参数见表2。

二、结果与讨论

1.提取溶剂的选择。本文考察了0.5%三氯乙酸-乙腈（1∶1、v/ v）、1.0%三氯乙酸-乙腈（1∶1、v/ v ）、0.5%三氯乙酸-甲醇（1∶1、v/ v）、1.0%三氯乙酸-甲醇（1∶1、v/ v）四种溶剂。

实验结果表明，1.0%的三氯乙酸-甲醇和1.0%的三氯乙酸-乙腈提取液沉淀蛋白的能力明显优于0.5%三氯乙酸-乙腈和0.5%三氯乙酸-甲醇提取液，由于1.0%的三氯乙酸为提取液提供了更好的酸性环境，更有助于目标物在MCX固相萃取小柱上附着，所以含有1.0%的三氯乙酸的提取液的回收率（80%左右）也高于含有0.5%的三氯乙酸的提取液（60%左右）。1.0%的三氯乙酸-甲醇与1.0%的三氯乙酸-乙腈回收率差别不明显，但是1.0%的三氯乙酸-甲醇混合溶液作为提取液，提取后的溶液更澄清，而且甲醇的价格比乙腈低廉、生物毒性也低于乙腈，所以选择1.0%的三氯乙酸-甲醇作为貉肉组织中金刚烷胺的提取溶剂。

表1 金刚烷胺洗脱梯度

表2 金刚烷胺多反应监测质谱参数

为了降低基质干扰、富集目标物、提高检测灵敏度，本研究采用固相萃取净化法，比较了 Waters Oasis HLB（3毫升/60毫克）、Waters Oasis MCX（3毫升/60毫克)、Waters Oasis MAX（3毫升/60毫克）、CNWBOND SCX（500毫克，3毫升）和传统的C18小柱的净化效果。结果表明 ，金刚烷胺在传统C18 小柱上几乎无回收，在Waters Oasis MCX、Waters Oasis HLB、Waters Oasis MAX和CNWBOND SCX小柱上均有不同程度的回收，其中Waters Oasis MCX 的回收率均最高。最终实验选择采用Waters Oasis MCX（3毫升/60毫克）固相萃取小柱净化样品 。

2.液相条件的优化。本实验选择Waters UPLC BEH C18色谱柱、0.1%甲酸水和乙腈为流动相对金刚烷胺进行分离，通过调节流动相比例，发现相同浓度样品采用梯度洗脱比等度洗脱的响应提高2倍以上。而且梯度洗脱中，在金刚烷胺出峰后流动相保持60%乙腈冲洗色谱柱1分钟然后逐渐降到初始浓度，可以充分洗脱出色谱柱中残留的大分子蛋白，避免了长期使用时杂质在色谱柱中产生沉淀积累，影响分离效果。柱温箱温度选择40℃，可以避免环境温度对柱温的影响导致保留时间的波动，保证保留时间的稳定。

3.质谱条件的优化。由于金刚烷胺含有氨基，容易得到H+而形成稳定的[M+]+准分子离子，因而选择ESI正离子方法进行监测。将500纳克/毫升的标准溶液以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子扫描，确定金刚烷胺的分子离子m/z 151.93。 然后对其子离子进行全扫描，碎片离子主要为m/z 135.04、m/z 93.01。因为m/z 135.04信号强且较为稳定，故以135.04为定量离子。

驻留时间（dwell time）影响检测的精确度和灵敏度。当调节驻留时间为0.161秒时，得到的离子的准确度高，重现性好，峰形明显变好。

4.液相色谱线性考察及添加回收试验。

（1）标准曲线。分别配制盐酸金刚烷胺质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50微克/升的系列混合标准溶液，在选定的色谱质谱条件下进行测定，以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算，在0.1～50微克/升的范围内标准曲线方程为Y=2757.67X+54.1375，线性关系良好，其相关系数r2为0.999，详见图1。

（2）回收率和精密度。貉子肉中添加不同浓度的盐酸金刚烷胺，前处理后由高至低检测，在保证同时分离出定量离子和定性离子的前提下， 确定貉子肉中盐酸金刚烷胺的检出限为0.2微克/千克， 定量限为0.5微克/千克。

貉肉的添加回收和精密度试验，添加水平为 0.5、1.0、2.0微克/千克，每个添加浓度重复三次试验，添加、混合后静置使样品溶液被样品充分吸收。然后按照本方法进行样品处理和测定，每个添加样品测定6次，结果阳性添加样品的回收率在75%～91%，平均回收率在81.8%～86.9%，精密度在1.9%～3.5%（见表3）。各特征离子质量色谱图见图2～图4。

表3 貉肉中盐酸金刚烷胺的回收率和精密度

三、结论

本文建立貉肉中盐酸金刚烷胺的液相色谱-串联质谱测定方法。貉肉样品经1%三氯乙酸-甲醇（1∶1, v/ v）提取，经固相萃取柱净化、浓缩后, 采用超高效液相色谱-串联质谱法在正离子模式下检测金刚烷胺。本实验采用外标法进行定量, 方法检测限为0.2微克/千克，定量限 0.5微克/千克，金刚烷胺平均回收率为81.8%～86.9%，相对标准偏差为 1.9%～3.5%（n=3）。本方法灵敏度高、准确性好、适用于貉肉中金刚烷胺残留的检测。

◎图1 检验方法校准曲线

◎图2 盐酸金刚烷胺标准品MRM色谱图（2.0微克/千克）

◎图3 空白貉肉中金刚烷胺MRM色谱图

◎图4 空白貉肉中添加盐酸金刚烷胺MRM色谱图（2.0微克/千克）