虎舌红多糖超声波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性评价

邵金华 马永强 何福林 黎 涛 杨宇翔

(1. 哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150076；2. 湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南 永州 425100；3. 湖南科技学院，湖南 永州 425100)

虎舌红多糖超声波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性评价

邵金华1,2,3马永强1何福林2,3黎 涛2,3杨宇翔2,3

(1. 哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150076；2. 湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南 永州 425100；3. 湖南科技学院，湖南 永州 425100)

以虎舌红为原料，蒸馏水为提取剂，对超声波辅助提取虎舌红多糖的工艺进行优化，并对虎舌红多糖的抗氧化性进行评价。结果表明：虎舌红多糖最佳提取工艺为提取温度65 ℃，提取时间20 min，料液比1∶15(g/mL)，提取次数4 次，该条件下虎舌红多糖得率为(3.42±0.28) mg/g。虎舌红多糖有较好的抗氧化活性，当多糖浓度达到4 mg/mL时，对DPPH清除率强于相同浓度BHT；0.5%多糖对猪油抗氧化效果与相同浓度BHT相当。

虎舌红；多糖；超声波辅助提取；抗氧化活性

虎舌红(ArdisiamamillataHance)，是紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(ArdisiaSwartz)植物，又叫天仙红衣、金丝红珠、红毛毡、毛凉伞、宝鼎红等，原产于中国，分布于湖南、广西、四川、江西等地[1]。该植物多供药用，具清热利湿、止咳化痰、抗癌、消肿解毒、活血止血等功效[2]。目前，对于虎舌红活性成分的研究，主要集中于虎舌红挥发油[3]、生物碱[4]、黄酮类成分[5-6]的研究。

多糖是一种重要的活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、调节免疫、抗衰老、抗凝血的功能[7]。目前，对虎舌红多糖的研究较少，仅有一篇[8]关于虎舌红分离纯化与性质研究，在80 ℃下加热回流水提取。关于虎舌红多糖超声波辅助提取工艺及其抗氧化活性的研究，未见有相关报道。加热回流水提，能量消耗大、提取时间长、得率较低，而且多糖在提取的过程中容易造成降解，活性降低[9]。超声波辅助提取法具有效率高、耗能低、溶剂用量少等特点，已应用于多种植物有效成分提取[10-11]，但在虎舌红多糖提取方面未见应用报道。本研究拟采用超声波辅助水提法提取虎舌红多糖，考察各个因素对虎舌红多糖得率的影响，在单因素试验基础上，利用正交试验对试验条件进行优化，并对其抗氧化活性进行评价，旨在为虎舌红多糖进一步研究提供理论基础，为新型抗氧化剂开发提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 材料与试剂

虎舌红：采摘自湖南省永州湖南科技学院西山；

猪油：本实验室用市售猪板油制得；

葡萄糖、抗坏血酸、硫酸、苯酚、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：分析纯，天津博迪化工股份有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

超声波细胞粉碎机：scient29s-IIIN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

可见分光光度计：H722B型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

电热真空干燥箱：DZF-6020型，北京中科环试仪器有限公司；

电子天平：JA3003型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

旋转蒸发仪：R201D-Ⅱ型，郑州长城科工贸易有限公司；

循环水式真空泵：SHZ型，巩义市予博仪器设备贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖提取流程

虎舌红全草→切成1 cm小段→60 ℃烘干、粉碎，过60目筛→乙醚回流脱脂[料液比1∶25(g/mL)，回流脱脂3 h]→脱脂后的残渣烘干(真空干燥60 ℃)、粉碎(40目)→超声波辅助蒸馏水提取→纱布过滤后抽滤→上清液(粗提取液)→活性炭脱色(2.5%搅拌40 min)→抽滤→上清液真空浓缩(75 ℃)为原体积的1/4→加入无水乙醇，至乙醇的终体积分数为75%→静置36 h后取沉淀→65 ℃真空干燥→虎舌红粗多糖

1.3.2 虎舌红多糖含量测定 采用苯酚—硫酸法[12]。

(1) 葡萄糖标准曲线绘制：精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品50 mg，置于500 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖对照品贮备液。准确量取上述对照品贮备液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，再分别各取1 mL加浓硫酸7.5 mL和5%苯酚1.5 mL，在490 nm波长处测定吸光度(A490 nm)。

(2) 样品多糖的含量测定：将浓缩的虎舌红多糖提取液置于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，取1 mL加浓硫酸7.5 mL和5% 苯酚1.5 mL，在490 nm波长处测定吸光度(A490 nm)。虎舌红多糖得率按式(1)计算：

(1)

式中：

P——多糖得率，mg/g；

c——样品浓度，μg/mL；

n——稀释倍数；

v——稀释体积，mL；

m——样品质量，g。

1.3.3 虎舌红多糖提取工艺优化

(1) 料液比对虎舌红多糖得率的影响：准确称取10.0 g 虎舌红脱脂后干燥粉末，料液比分别为1∶ 15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)，超声温度为55 ℃，提取时间20 min(提取3 s，间隔2 s)，提取次数1次，考察料液比对多糖提取得率的影响。

(2) 提取时间对虎舌红多糖得率的影响：准确称取10.0 g 虎舌红脱脂后干燥粉末，料液比按1.3.3(1)最优值，设置超声波提取时间分别为10，15，20，25，30 min(提取3 s，间隔2 s)，提取温度55 ℃，提取1次，考察提取时间对虎舌红多糖提取得率的影响。

(3) 提取温度对虎舌红多糖得率的影响：准确称取10.0 g 虎舌红脱脂后干燥粉末，料液比按1.3.3(1)最优值，设置超声波提取时间为1.3.3(2)最优值，水提，设置提取温度为50，55，60，65，70 ℃，提取1次，考察提取温度对虎舌红多糖提取得率的影响。

(4) 提取次数对虎舌红多糖得率的影响：准确称取10.0 g 虎舌红脱脂后干燥粉末，料液比按1.3.3(1)最优值，设置超声波提取时间为1.3.3(2)最优值，提取温度为1.3.3(3)最优值，分别提取1，2，3，4，5次，考察超声温度对虎舌红多糖提取得率的影响。

(5) 正交优化设计：在单因素试验的基础上，以多糖提取得率为检测指标，采用L9(34)进行4因素3水平正交试验，综合考察多因素对多糖提取得率的影响。

1.3.4 多糖抗氧化活性检测

(1) DPPH自由基清除能力测定：向试管中依次加入6.5×10-5mol/L DPPH·溶液2.5 mL，分别加入5，10，15，20，25 mg/mL虎舌红多糖提取液1 mL、相同浓度BHT(阳性对照)，蒸馏水补足到 4 mL，蒸馏水做对照，各管混合均匀，避光保存20 min后，在517 nm 处测定吸光度值[13]。样品对 DPPH自由基的清除率按式(2)计算：

(2)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

A0——对照吸光度；

A——样品吸光度。

(2) 虎舌红多糖对猪油抗氧化能力测定：将猪油试样100 g，按照质量百分比 0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%加入虎舌红多糖，以0.5% BHT为对照，搅拌均匀，然后置于(60±2) ℃的烘箱自氧化，每 48 h 取样测定猪油的过氧化值[14]。按GB/T 5538—2005 测定油脂的过氧化值。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线绘制

由图1可知，在10～50 μg/mL的浓度范围内，葡萄糖标准溶液浓度与吸光度有良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 虎舌红多糖提取工艺优化

2.2.1 料液比对虎舌红多糖得率的影响 由图2可知，随着溶剂量的增加，虎舌红多糖得率逐渐增大，当料液比为1∶20(g/mL)时，多糖得率最大，之后多糖得率反而降低。在相同条件下，随着溶剂量的增加，多糖溶出量增加，溶剂量达到一定值后，多糖完全溶出，再增加溶剂的量，多糖得率不再增加，反而下降，可能是随着溶剂增加，促进了其它物质溶出，抑制多糖溶出；再者，溶剂量的增加，为后续浓缩操作带来困难，影响脱色剂用量。综合考虑，确定最佳料液比为1∶20(g/mL)。

不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)

Figure 2 Effect of material- liquid ratio on yield of polysaccharides fromArdisiamamillataHance

2.2.2 提取时间对虎舌红多糖得率的影响 由图3可知，随着提取时间的增加，虎舌红多糖的得率也随之增大，在25 min时达到一个最大值，之后虎舌红多糖的得率下降，可能是提取时间过长，虎舌红多糖分解产生单糖，从而导致虎舌红多糖得率下降。综合考虑，确定最佳提取时间为25 min。2.2.3 提取温度对虎舌红多糖得率的影响 由图4可知，随着提取温度提高，虎舌红多糖得率增大，达到60 ℃时，得率最高，之后虎舌红多糖得率下降。可能是随着提取温度升高，液体介质黏度以及表面张力降低，但液体蒸气压增大，因而在液体介质中间容易拉开进而形成空化作用，使细胞破碎度增加，促使细胞多糖向外扩散，促使多糖得率增大，但当温度再增加，使细胞破碎度过大，促使多糖外的其它杂质被溶出，多糖得率下降。因此，确定60 ℃为最佳提取温度。

不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)

不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)

Figure 4 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides fromArdisiamamillataHance

2.2.4 提取次数对虎舌红多糖得率的影响 由图5可知，随着提取次数增加，多糖得率逐渐增加，提取次数达到3次后再增加提取次数时，多糖得率变化不大。可能是提取3次后，多糖已经完全浸出，固液相达到了平衡，再者，提取次数增加，能量消耗增大。综合考虑，虎舌红多糖提取次数选择3次。

不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)

Figure 5 Effect of extraction times on yield of polysaccharides fromArdisiamamillataHance

2.2.5 正交试验 正交试验因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

由表2可知，影响虎舌红多糖得率因素的次序为：C>A>B>D，最佳工艺参数为：A3B1C1D3，即超声温度为65 ℃，超声时间为20 min，料液比为1∶15(g/mL)，提取次数为4次。由表3方差分析可知，超声温度、超声时间、料液比对虎舌红多糖得率都有显著影响。由于正交表中无A3B1C1D3试验组，对此试验组进行了3次验证实验，此条件下，虎舌红多糖得率为(3.42±0.28) mg/g，得率高于其它试验组。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表†

†F临界值19.000；*表示差异显著，P<0.05。

2.3 虎舌红多糖抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定 由图6可知，随着虎舌红多糖、BHT浓度增大，对DPPH清除率逐渐增大，呈现一定的量效关系，当虎舌红多糖浓度达到4 mg/mL时，其对DPPH清除率效果强于BHT。

2.3.2 虎舌红多糖对猪油抗氧化能力测定 由表4可知，随着多糖含量增加，对猪油的抗氧化效果增强，0.05% 多糖与0.05% BHT抗氧化效果较接近，此时，BHT抗氧化效果好于多糖；当多糖浓度达到0.07%，多糖的抗氧化效果好于BHT。由此可见，虎舌红多糖抗氧化效果较好，但是因为其是粗多糖，需要进一步纯化，纯化后的抗氧化效果可能好于BHT。

不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)

Figure 6 Inhibitory effects of polysaccharides fromArdisiamamillataHance and BHT on DPPH

表4 虎舌红多糖、BHT对猪油抗氧化作用

3 结论

本试验结果表明，虎舌红多糖超声辅助提取工艺的最佳条件为提取温度65 ℃，提取时间20 min，料液比1∶15(g/mL)，提取4次，该条件下虎舌红多糖得率为(3.42±0.28) mg/g。

通过本试验证明虎舌红多糖具有较好的抗氧化活性，粗多糖浓度达到5 mg/mL时，对DPPH清除率强于相同浓度BHT，在对猪油抗氧化试验过程中发现，粗多糖浓度达到0.7%时，对猪油的抗氧化效果强于对照0.5% BHT。虎舌红粗多糖的后续纯化、结构分析以及其结构与抗氧化性构效关系研究还有待进一步研究。

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Ultrasonic-assisted extraction of polysaccharide from ardisia mamillata and the evaluation of its antioxidant activity

SHAO Jin-hua1,2,3MAYong-qiang1HEFu-lin2,3LITao2,3YANGYu-xiang2,3

(1.HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China; 2.KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationofAdvantagePlantsResourcesinHunanSouth,Yongzhou,Hunan425100,China; 3.HunanUniversityofScienceandTechnology,Yongzhou,Hunan425100,China)

A orthogonal test was utilized to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of the polysaccharide inArdisiamamillatabased on the single-factor experiment, and its antioxidant activity was evaluated. The results demonstrated that the polysaccharide inArdisiamamillatacould be extracted best by using distilled water as the extracting agent, with the solid-liquid ratio 1∶15(g/mL)was treated , ultrasonated at 65 ℃ for 20 min, for 4 times. Thus the extracting rate of the polysaccharide fromArdisiamamillatawas (3.42±0.28) mg/g. Moreover, it was also found that the polysaccharide formArdisiamamillatapossessed good antioxidant activity. It was tested that the polysaccharide showed stronger clear ability of DPPH than that of BHT at concentration 4 mg/mL, and 0.5% polysaccharide had comparable antioxidant effect on lard with that of BHT.

Ardisiamamillata; polysaccharide, ultrasonic-assisted extraction, antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.036

湖南省教育厅重点项目(编号：16A904)

邵金华，女，湖南科技学院高级实验师，哈尔滨商业大学在读博士研究生。

马永强(1963—)，男，哈尔滨商业大学教授，博士。 E-mail: qyma163@126.com

2016—09—30