基于三元二次正交设计的文蛤水解肽制备工艺优化及ACE抑制活性分析

于志鹏,吴 雨,樊 玥,赵文竹,*,丁 龙,曲艾钰,刘静波,励建荣,*

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062)

基于三元二次正交设计的文蛤水解肽制备工艺优化及ACE抑制活性分析

于志鹏1,吴 雨1,樊 玥1,赵文竹1,*,丁 龙2,曲艾钰1,刘静波2,励建荣1,*

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062)

本文以文蛤蛋白为原料,选用复合蛋白酶进行酶解并以水解度作为测定指标,在单因素实验基础上进行三元二次正交设计,对获得最优工艺参数进行验证,并对文蛤ACE抑制肽的活性及氨基酸组分进行分析。通过单因素实验得出文蛤ACE抑制肽酶解最优工艺参数为底物浓度10%,酶解pH8.7,加酶量4.5%和酶解温度51 ℃,酶解时间3 h,此酶解工艺条件下对应的水解度为33%,酶解液离心所得上清液经HPLC测定其ACE抑制率为35%。

文蛤,活性肽,酶解,结构表征

文蛤属软体动物门、双壳纲、真瓣鳃目、帘蛤科、文蛤属[1]。文蛤主要分布在我国山东、辽宁、江苏和广西地区,每年的采捕量最高达到25万吨[2]。文蛤中蛋白质含量丰富,氨基酸种类齐全,是酶法制备生物活性肽的良好原料。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中,存在着许多具有生物活性的氨基酸序列,用特定的蛋白酶水解,可释放出具有活性的肽段。

以海洋贝类、鱼类以及海产品加工下脚料等海洋蛋白为原料制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的研究越来越受到关注。目前已成功从青蛤[3]、鲑鱼皮[4]、草鱼[5]、鱼废弃物[6]中制备ACE抑制肽,活性肽的分子量主要集中在1000 u 以下,ACE抑制肽的半抑制浓度(IC50)数值主要分布在27～1.18 mg/mL。近些年来的研究表明,文蛤含有多种天然活性物质,能发挥多方面的生理调节功能[7-8],目前已有文献报道蛤蜊蛋白源活性肽具有ACE抑制活性[9-10]。

本研究拟利用复合蛋白酶酶解文蛤蛋白制备ACE抑制肽,酶解过程中实时监测反应体系水解度(DH)的变化,在单因素实验基础上通过三元二次正交实验设计建立复合酶制备文蛤活性肽的最优工艺参数,以期为生产实践提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜文蛤肉 购于兴隆大家庭购物中心(锦州);复合蛋白酶(活力1.5 AU-N/g) 诺维信公司。

HH-2数显恒温水浴锅 金坛大地自动化仪器厂;JJ-1精密增力电动搅拌器 江苏省金坛市自动化仪器厂;MG5302电动绞肉机 佛山市海迅电器有限公司;AG204 型电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;全自动氨基酸分析仪L-8900 日本株式会社日立制作所;高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 文蛤蛋白活性肽的酶解工艺 取一定量新鲜文蛤肉经绞肉机绞成肉糜,并制成一定浓度的文蛤肉糜水溶液,之后转移到水解瓶中,置于超级恒温水浴锅中调整至所需酶解温度、底物浓度、加酶量和pH,最后加入一定量的复合蛋白酶启动水解。水解过程中不断搅拌,每隔30 min 测定酶解液pH,并不断加入0.1 mol/L NaOH溶液以维持pH在规定的范围内(±0.05),记录每次加入NaOH溶液的量,根据所消耗NaOH的量进行水解度计算。酶解180 min后经100 ℃灭酶10 min,之后在4 ℃条件下 6000×g离心10 min,取上清液冷冻干燥,保存备用。

1.2.2 单因素实验 以水解度为指标,经单因素实验初步考察酶解温度、加酶量、底物浓度和pH四个因素对复合蛋白酶水解文蛤蛋白制备活性肽的水解度的影响。

将文蛤肉糜水溶液调整pH分别在6、7、8、9、10和11条件下,并在底物浓度6%、加酶量3%和50 ℃情况下酶解3 h,考察pH对文蛤水解效果的影响。

设定文蛤肉糜水解温度分别为40、50、55、60和70 ℃,并在底物浓度6%、加酶量3%和pH为8情况下酶解3 h,研究温度对文蛤水解效果的影响。

将加酶量分别设定为1%、3%、5%和7%,并在pH为8、底物浓度6%和50 ℃情况下酶解解3 h,评价加酶量对文蛤水解效果的影响。

将文蛤肉糜底物浓度分别配制为2%、6%、8%、10%、12%、18%,并在pH为8、加酶量3%和50 ℃情况下酶解3 h,考察底物浓度对文蛤水解效果的影响。

1.2.3 酶解文蛤蛋白制备活性肽三元二次回归正交模型 在单因素实验基础上,进行三元二次回归正交实验设计优化,分别考察温度、加酶量、底物浓度和pH及其他两因素交互作用和因素r次项对水解效果的影响,因素水平见表1。

表1 因素水平编码表

1.2.4 酶解蛋白质水解度(DH)的测定 水解度测定采用pH-stat法。

1.2.5 血管紧张素转化酶抑制活性的测定 采用高效液相色谱法,具体步骤如下:取30 μL HHL底物液,加入10 μL抑制剂混合均匀,在(37±0.5 ℃)恒温水浴中预热3～5 min,然后加入20 μL ACE(2.0 units/mg protein)液充分混合,37 ℃保温30 min后,再加入60 μL的1 moL/LHCl终止反应,得到反应液,同时用10 μL pH为8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组[8-10]。该反应液用0.45 μm滤膜过滤后直接用HPLC系统进行分析。色谱条件:Inertsil WP300 C18色谱柱(125 mm×4.0 mm,5 μm),柱温25 ℃,流速0.5 mL/min,流动相乙腈/水(0.05% TFA)比例为25/75等梯度洗脱,检测波长228 nm[5]。

ACE抑制活性计算公式如下:

ACE抑制活性(%)=100(M-N)/M

式中:M为空白对照组中马尿酸的峰面积,N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。

配制不同浓度的文蛤蛋白活性肽的水溶液,按照血管紧张素转化酶抑制活性测定方法测定而获得不同浓度样品对ACE活性的抑制率。

1.2.6 活性肽组分氨基酸分析 参考国标GB/T 5009.124-2003,具体操作过程为:准确吸取文蛤ACE抑制肽溶液 300 μL于安剖瓶中,加入6 mol/L盐酸10 mL,氮吹仪充氮气2 min,酒精喷灯封口,置于110 ℃恒温箱内酸解22 h。取出,自然冷却后开管,吸取1 mL置于烧杯内,放入真空干燥箱,温度设为50 ℃,真空干燥7 h后取出,吸取2 mL 0.02 N盐酸复溶。吸取1.5 mL 过0.22 μm膜后置于上样瓶内,利用全自动氨基酸分析仪L-8900进行测定。

1.2.8 数据统计分析 采用Origin对数据进行处理分析,样品测定结果采用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 pH对水解效果的影响

文蛤蛋白水解效果随pH影响的变化趋势见图1。图1表明在pH为7、8、9和10条件下酶解3 h,结果发现在pH为8条件下的水解度最高,表明在此条件下复合蛋白酶水解文蛤蛋白效果最佳。水解度随着pH出现先增大后减小的现象,表明复合蛋白酶都有一个最适pH,在最适pH时酶活性最大,此时对应的蛋白水解效果较好。因此,复合蛋白酶酶解文蛤蛋白制备活性肽在pH为8条件下进行后续实验。

图1 pH对水解效果的影响Fig.1 Influence of pH on the degree of hydrolysis

2.2 温度对水解效果的影响

由图2可知,温度由40～60 ℃升高过程中,水解度逐渐升高;当酶解温度在50～60 ℃时,随着温度升高其水解效果降低较快,在60～70 ℃时水解度变化趋于平缓。因此可以初步得出酶解温度为50 ℃时文蛤蛋白水解效果好。实验结果证明在一定温度范围内随着温度升高,酶促反应和一般化学反应一样反应速度加快;然而由于蛋白酶本质是蛋白质,当温度超过一定数值后,随着温度逐渐升高,蛋白酶因逐渐变性而失活,导致水解度降低。范秀萍等[11]在珠母贝糖蛋白分离提取工艺条件优化中也得出温度对糖蛋白提取效果相同的变化趋势。

图2 温度对水解效果的影响Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis

2.3 加酶量对水解效果的影响

在一定范围内,酶的用量增加有利于提高对底物蛋白质的水解程度,图3为加酶量分别为1%、3%、5%和7%时酶解3 h的水解效果,通过单因素方差分析表明加酶量由1%增加为3% 时,对应文蛤蛋白水解度显著升高;而3%、5%和7%加酶量对应的水解度差异不显著。主要是因为在1%～3%期间随着加酶量的增加,酶的利用量基本趋于饱和状态,但当加酶量达到3%以后,再增加加酶量无法提升水解度,可能此时酶的利用量处于不饱和状态,增加加酶量对水解度的影响不大。所以,综合考虑应选取加酶量3%为最佳条件。

2.4 底物浓度对水解效果的影响

蛋白酶必须溶解于水才能均匀分散于文蛤肉糜中,进而与底物接触并对其发生作用,实验结果如图4所示,底物浓度在2%～6%范围内时,水解度变化较为平缓。底物浓度在6%～8%范围内时,水解度逐渐升高,当底物浓度增加到10%时,水解度继续升高。其后在10%～18%范围内时,水解度逐渐降低。初步得出当底物浓度为10%时,文蛤蛋白水解效果较好。这主要是因为在底物浓度较低时,水分含量较高,虽然底物分配较均,但酶的浓度相对较低,所以水解度效果不理想;而当底物浓度过高时,文蛤蛋白在水中分配不均而影响了酶的催化速度及分子扩散,此时也影响水解效果。因此,综合考虑选取底物浓度为10% 进行后续优化实验研究。

图4 底物浓度对水解效果的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis

2.5 三元二次回归正交设计模型的建立

在单因素基础上进行了三元二次回归正交实验设计,结果见表2。

表2 三元二次回归正交实验结果

根据相关系数得到回归方程:Y=24.6+2.28X1+1.8X2+3.24X3-1.88X1X2+1.88X1X3+1.88X2X3-3.94X12-5.608X22-2.88X32

SR=66.55,fR=7;S回=677.3,f回=9;Se=20.67,fe=2;Slf=SR-Se=45.8,flf=fR-fe=5;F回=(S回/f回)/(SR/fR)=7.9>F0.01(9,7)=6.71,表明方程在0.01水平下显著,且满足Flf

根据西尔维斯特不等式判别方程的极值[12],设在稳点x0=(x01,x02,…,x0p)处,计算y=xj(j=1,2,…,p)的各阶偏导数,并且定义行列式Dj,并对3个变量依次计算3个行列式:D1=-7.88<0,D2=84.85>0,D3=-434.52<0。

根据西尔维斯特不等式判别方程可以得出方程有极大值,利用求驻点方法求得当水解度取得极值时,x1=0.42,x2=0.22,x3=0.78,将因素编码表代入方程中,即在底物浓度为10%,酶解pH为8.7,加酶量4.5%和酶解温度51 ℃条件下,酶解3 h所得的文蛤蛋白水解度为29%,并经实验验证水解度为33%与回归方程优化结果相近。

2.6 文蛤ACE抑制肽活性及氨基酸组分分析

利用高效液相色谱法对文蛤蛋白酶解液进行体外ACE抑制活性测定,结果表明文蛤活性肽(15 mg/mL)抑制率达到35%。通过对文蛤活性肽进行氨基酸分析,氨基酸组成含量见表3,脯氨酸含量较高。有研究发现蜥鱼肌肉蛋白ACE抑制肽RVCLP(IC50为175 μmol/L),其 C末端的疏水性氨基酸Pro 是使其具有较高ACE抑制活性的重要原因[13]。文蛤ACE抑制肽中脯氨酸含量较高,使其具有开发高活性ACE抑制肽的潜在优势,但由于目前仍为多种肽的混合物,需要后续的分离纯化以及活性验证。

表3 文蛤ACE抑制肽氨基酸含量测定结果

3 结论

本研究以文蛤蛋白为原料,利用复合蛋白酶进行酶解制备活性肽,其最优酶解工艺参数为底物浓度10%,酶解pH为8.7,加酶量4.5%、酶解温度51 ℃,酶解3 h 所得的文蛤蛋白水解度为33%。最优工艺参数下获得酶解液经离心后测定其上清液的ACE抑制活性为35%。文蛤蛋白源ACE抑制肽中氨基酸组成中谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量较高,分别为20.5、18.1和12.9 mmol/L。由于目前获得的文蛤蛋白源ACE 抑制肽为混合物,后续将重点进行活性肽的多维色谱分离和结构鉴定,并对其抑制ACE作用的构效关系进行研究。

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Enzyme hydrolysis preparation and ACE inhibitory activity s of bioactive Peptides fromMeretrixlusoria

YU Zhi-peng1,WU Yu1,FAN Yue1,ZHAO Wen-zhu1,*,DING Long2,QU Ai-yu1,LIU Jing-bo2,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; 2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Meretrix lusoria protein was hydrolyzed by protease enzyme through the ternary quadratic orthogonal design based on the single factor experiment,and bioactivity against angiotensin converting enzyme(ACE)of peptides was investigated. Optimal hydrolysis conditions were found that hydrolysis time was 3 h,the substrate concentration was 10%,the value of pH was 8.7,the addition of enzyme was 3% and the hydrolysis temperature was 51 ℃. The degree of hydrolysis was 33%.InvitroACE inhibitory activity of bioactive peptides fromMeretrixlusoriawas performed by high performance liquid chromatography. The results suggested that the activity against the ACE of bioactive peptides was 35%.

Meretrixlusoria;active peptide;enzymatic hydrolysis;characterization

2016-06-28

于志鹏(1984-)，男，博士，讲师，研究方向：蛋白质及活性肽的功能研究与产品开发,E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

*通讯作者:赵文竹(1986-)，女，博士，讲师，研究方向：营养与功能食品，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。 励建荣(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水产品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

国家科技支撑课题(2012BAD00B03)；渤海大学博士启动项目(0515bs079)；辽宁省科学事业公益基金项目(2016004004)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000