甜叶菊废渣提取物抑菌活性及抑菌稳定性研究

赵 磊,林文轩,迟 茜,王成涛,*,徐美利,连运河

(1.北京工商大学食品营养与人类健康北京高精尖创新中心,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048;2.晨光生物科技集团股份有限公司,河北邯郸 057250)

甜叶菊废渣提取物抑菌活性及抑菌稳定性研究

赵 磊1,林文轩1,迟 茜1,王成涛1,*,徐美利2,连运河2

(1.北京工商大学食品营养与人类健康北京高精尖创新中心,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048;2.晨光生物科技集团股份有限公司,河北邯郸 057250)

研究甜叶菊废渣提取物的抑菌活性及抑菌稳定性。甜叶菊絮凝废渣经酸性丙酮提取和乙酸乙酯萃取后得到甜叶菊废渣提取物。采用滤纸片扩散法和琼脂稀释法等测定甜叶菊废渣提取物的抑菌活性,并探讨热处理、紫外光、pH和金属离子对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响。结果表明,甜叶菊废渣提取物对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌具有良好的抑菌作用,最小抑菌浓度(或最小杀菌浓度)分别为3.13(6.25)、12.5(25)和12.5(12.5) mg/mL,但对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌作用。甜叶菊废渣提取物经100 ℃处理20 min仍具有较好的抑菌活性,紫外线处理使其对蜡样芽孢杆菌的抑菌活性降低,pH>7.0时对蜡样芽孢杆菌无抑菌作用,Na+、K+和Ca2+能够增强其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性,Fe2+和Fe3+使其抑菌活性丧失或降低。甜叶菊废渣提取物作为天然防腐剂使用具有广阔的开发和利用前景。

甜叶菊,废渣,抑菌,食源性细菌

甜叶菊,是一种多年生菊科草本植物,叶片中含有甜菊糖苷,其甜度为蔗糖的200～300倍,是一种极好的天然甜味剂[1]。我国是目前世界上最大的甜菊糖产品生产供应国,年产量约4000 t,甜菊叶年需求量约为4万吨,甜菊叶中含有丰富的黄酮类、绿原酸类、挥发油、萜类等活性物质[2],其中黄酮类和绿原酸类物质约占1%～2%,并具有抗菌、降血压、降血脂等生物活性[3]。在甜菊糖提取过程中,约80%的绿原酸类和黄酮类成分随甜菊糖一起浸出,甜叶菊絮凝废渣是生产甜菊糖苷过程中产生的废弃物,尚未得到很好利用,造成了甜叶菊资源的极大浪费,如何综合利用甜叶菊废渣不仅关系到环境问题,还影响企业的效益。

近年来发现,甜叶菊提取物对微生物具有一定的抑菌作用。任晓静等报道了甜叶菊水提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢柑橘具有较好的抑菌作用,并具有较好的pH和温度稳定性[4]。Jayaraman等报道了甜叶菊乙酸乙酯和丙酮提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌等表现出较好的抗菌活性[5]。甜叶菊中含有丰富的绿原酸类化合物,Karakose等采用串联质谱法在甜叶菊叶中检测出咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸和三咖啡酰奎宁酸等24种绿原酸类化合物[6]。付晓等采用HPLC法从甜叶菊中检测出绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸3种绿原酸类化合物[7]。研究表明,绿原酸及富含绿原酸的植物提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较好的抑菌作用[8-11]。因此,开发利用甜叶菊废渣,研究甜叶菊废渣提取物的抑菌作用,可为实现甜叶菊渣低成本、无二次污染的综合利用提供新思路。

本文以甜叶菊废渣提取物为原料,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌为供试菌,分别对其抑菌活性及抑菌稳定性进行研究,以期为采用甜叶菊废渣开发新型天然食品防腐剂和饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜叶菊废渣提取物 由晨光生物科技集团股份有限公司提供;Mueller-Hinton琼脂(MHA)、Mueller-Hinton肉汤(MHB) 北京奥博星生物技术有限责任公司;金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcusaureus)AS1.89、大肠杆菌(Escherichiacoli)AS1.90、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)AS1.1849、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)AS1.1846、鼠伤寒沙门氏菌(SamonellaTyphimurium)AS1.1174 中科院微生物所;其他试剂 均为国产分析纯。

SPECTRA MAX 190连续波长酶标仪 美国MD公司;HQ45恒温摇床 中国科学院武汉科学仪器厂;ZWP-A1230恒温恒湿培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司;SW-CJ-2FD双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;pH400型pH计 安莱立思仪器科技(上海)有限公司;MLS-3750高压蒸汽灭菌器 三洋电机株式会社。

1.2 甜叶菊废渣提取物抑菌活性的研究

1.2.1 甜叶菊废渣提取物的制备 甜叶菊絮凝废渣→酸性95%丙酮水溶液45 ℃提取→提取液浓缩→乙酸乙酯萃取→浓缩、干燥→甜叶菊废渣提取物,采用HPLC法测定甜叶菊废渣提取物中绿原酸类和黄酮类成分含量[12],测得其总绿原酸含量为48.5%,总黄酮含量为9.7%。

1.2.2 菌种的活化及菌悬液制备 将菌种从斜面上用接种环接到新鲜MHA培养基斜面上,各细菌于37 ℃培养箱培养24 h。随后,分别从活化的菌种斜面上用接种环刮取少量菌体接种于已灭菌的MHB培养基,采用平板活菌计数法[13]测定蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的原始菌液浓度,最后将制备好的菌液置于4 ℃保存备用。

1.2.3 滤纸片扩散法 将原始菌液用MHB液体培养基稀释至浓度为0.8～1.2×106CFU/mL。吸取100 μL上述菌液于无菌培养皿中,再加入MHA培养基后混匀。吸取10 μL 100 mg/mL甜叶菊废渣提取物于直径为6 mm的滤纸片上,将滤纸片放置在已凝固的混有菌液的MHA培养基上,同时做空白对照,在37 ℃培养箱中培养24 h后观察结果[14]。通过测定抑菌圈的直径来评价甜叶菊废渣提取物对5种食源性细菌的抑菌作用。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 采用液体倍比稀释法,吸取1 mL甜叶菊废渣提取物溶液与9 mL MHA培养基加入到无菌培养皿中,制成50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL的带样平板,吸取0.1 mL 0.8～1.2×106CFU/mL菌悬液均匀的涂布在固体培养基上,以无菌水代替样品作为空白对照,在37 ℃培养箱中培养24 h,以抑制菌株生长的平板所含最低样品浓度为MIC。将以上测出的MIC以上浓度的培养基表面用无菌水冲洗,将冲洗液接种到无菌MHA培养基上,涂布均匀,在37 ℃培养36 h,以与正常MHA培养基表面无菌落生长相对应的最小样品浓度,即为该样品对供试菌的MBC[15]。

1.2.5 时间—抗菌曲线的测定 将原始菌液用MHB液体培养基稀释至浓度为0.8～1.2×106CFU/mL。于96孔板中每孔加入5 μL不同浓度的甜叶菊废渣提取物溶液,再加入150 μL菌悬液,混匀,使甜叶菊废渣提取物的终浓度达到0.5、1和2 mg/mL。以无菌水代替样品作为对照。将96孔板置于培养箱中,于37 ℃培养,分别于0,1,2,4,6,8,10,16,20,24 h取出,使用酶标仪在600 nm波长处测定菌液的浊度。以时间为横坐标,各时间点测得的菌液浊度作为纵坐标,绘制时间—抗菌曲线图[16,17],并计算抑菌率。抑菌率计算公式为:抑菌率(%)=[(OD600对照组-OD600实验组)/OD600对照组]×100

1.3 甜叶菊废渣提取物抑菌稳定性的研究[18]

表1 甜叶菊废渣提取物对不同供试菌的抑菌活性

注:§,甜叶菊废渣提取物浓度为100 mg/mL;-,没有抑菌作用。1.3.1 温度对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 将100 mg/mL甜叶菊废渣提取物至于40、60、80和100 ℃下处理20 min,通过测定抑菌圈的直径,确定抑菌活性。同时以相同浓度未经处理的甜叶菊废渣提取物作为对照。

1.3.2 pH对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 将100 mg/mL甜叶菊废渣提取物用0.1 mol/mL的HCl或NaOH调节为pH为4、5、6、7、8,平衡24 h后测量抑菌圈的直径,确定抑菌活性。同时以相同浓度未处理的甜叶菊废渣提取物作为对照。

1.3.3 紫外光对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 将100 mg/mL甜叶菊废渣提取物置于紫外光下照射5、10、15、20、25 min后,测量其抑菌圈的直径,确定抑菌活性。同时以相同浓度未处理的甜叶菊废渣提取物作为对照。

1.3.4 金属离子对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 将100 mg/mL甜叶菊废渣提取物分别用0.01 mol/L的Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+五种金属离子溶液处理,测量各组抑菌直径,确定抑菌活性。同时以相同浓度未处理的甜叶菊废渣提取物作为对照。

1.4 统计分析

每个实验至少重复三次,实验结果以均值±标准偏差(Mean±S.D.)表示,数据统计用SPSS 18.0统计软件进行处理,采用ANOVA单因素方差分析和Duncan多重比较检验。p<0.05具有显著性差异,p<0.01具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 甜叶菊废渣提取物对不同供试菌的抑菌活性

由表1所示,甜叶菊废渣提取物(100 mg/mL)对沙门氏菌、大肠杆菌没有抑菌作用;对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用显著,其抑菌圈直径分别为1.27,1.53和2.82 cm。甜叶菊废渣提取物对枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的MIC均为12.5 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC为3.13 mg/mL;甜叶菊废渣提取物对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MBC分别为12.5、25和6.25 mg/mL。由此可知,甜叶菊废渣提取物对供试G+菌的抑菌作用强于供试G-菌,对G+菌的抑菌作用强弱顺序为:金黄色葡萄球菌>蜡样芽孢杆菌≈枯草芽孢杆菌。任晓静等报道了甜叶菊水提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌作用,MIC分别为8.4、8.4和4.2 mg/mL,并对所选三种供试菌的抑菌作用强弱顺序为:枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌[4]。这与我们的研究结果有较大差异,推测甜叶菊废渣提取物与甜叶菊水提取物组成成分及含量存在不同,这可能与选用原料和提取方法不同有关,从而导致抑菌结果存在差异。

2.2 甜叶菊废渣提取物的时间-抗菌曲线

由2.1结果可知,甜叶菊废渣提取物在所选浓度范围内对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用,而对大肠杆菌和沙门氏菌均无抑菌作用,故仅针对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌,测定其时间-抗菌曲线。

图1 甜叶菊废渣提取物对蜡样芽孢杆菌(A)、枯草芽孢杆菌(B)和金黄色葡萄球菌(C)的时间-抗菌曲线Fig.1 The growth curve and time-kill curve of Bacillus cereus(A),Bacillus subtilis(B)and Staphylococcus aureus(C)at various concentrations of stevia rebaudiana waste extract

甜叶菊废渣提取物对对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的时间—抗菌曲线如图1所示。空白对照组表示未加入甜叶菊废渣提取物的体系中各菌种随时间的变化。当浓度为1、2 mg/mL时,甜叶菊废渣提取物对3种供试菌均无明显的抑菌作用。当浓度为2 mg/mL时,甜叶菊废渣提取物对3种供试菌均具有较强的抑菌作用,从菌体生长对数期开始可使菌悬液OD值明显下降。与空白对照组比,甜叶菊废渣提取物在24 h时对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别达到19.6%、15.6%和21.9%。总体而言,甜叶菊废渣提取物对于3种供试菌的抑菌效果随浓度的增加而增强。

2.3 甜叶菊废渣提取物抑菌稳定稳定性的研究

2.3.1 温度对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 由表2可知,不同温度处理后甜叶菊废渣提取物对枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径无显著性影响,抑菌活性基本保持不变,表明甜叶菊废渣提取物中的抑菌成分具有较高的热稳定性。但是对于金黄色葡萄球菌,随着对甜叶菊废渣提取物处理温度的增加,在80和100 ℃时抑菌效果减弱,但仍可保留77.7%以上。黄和等研究发现番石榴多酚对金黄色葡萄球菌的抑菌稳定性较好,但是处理温度在80 ℃附近时其抑菌活性也有小幅度的下降[19],这与本研究结果相似,具体原因有待进一步研究。总的来说,甜叶菊废渣提取物经高温处理后仍能保持较强的抑菌活性,具有良好的抗热性,与任晓静等报道的相一致[4]。这表明,甜叶菊废渣提取物作为防腐剂可以添加到需进行热加工处理的食品或饲料中。

表2 温度对甜叶菊废渣提取物的抑菌圈直径的影响

注:abc同列中标有不同字母的数值存在显著性差异(p<0.05);—,没有抑菌作用;表3～表5同。

2.3.2 pH对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 如表3所示,甜叶菊废渣提取物对供试菌在较宽的pH范围内都有抑菌活性,但是略有波动。不同pH甜叶菊废渣提取物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用无显著性差异。然而,酸性条件处理后甜叶菊废渣提取物对蜡样芽孢杆菌的抑菌活性比在碱性条件处理后强,未经处理的(pH2.8)甜叶菊废渣提取物的抑菌活性最高,pH超过7.0以后,抑菌效果消失。分析原因可能因为甜叶菊废渣提取物中的绿原酸类物质自然情况下呈酸性,降低pH能引起其所带酚羟基电离度变小,疏水性增强,更易溶于细胞膜的脂相及蛋白质的疏水区域,使其抑菌效果好[20]。而在碱性环境中绿原酸类物质会发生水解生成醌类[21],从而引起抑菌活性的减弱。总体上看甜叶菊废渣提取物在较广的pH范围内,对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好。但对于蜡样芽孢杆菌,甜叶菊废渣提取物仅在pH<7.0的环境下才能发挥抑菌作用,这可能与不同微生物的细胞结构存在差异有关。

表3 pH对甜叶菊废渣提取物的抑菌圈直径的影响

2.3.3 紫外光对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 如表4所示,紫外光照射使甜叶菊废渣提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用基本不受影响,而对蜡样芽孢杆菌的抑菌作用明显减弱,但仍保留82.3%以上。可见,紫外光对甜叶菊废渣提取物的抑菌活性的影响与菌种有关,可能因为其对不同菌种的抑菌机制存在差异,或者紫外光照射可能破坏了甜叶菊废渣提取物中对蜡样芽孢杆菌发挥主要抑菌作用的成分。总的来说,甜叶菊废渣提取物在自然环境中存放能够对抗紫外线,极大程度地保证其较好的发挥抑菌作用。

表4 紫外光对甜叶菊废渣提取物的抑菌圈直径的影响

2.3.4 金属离子对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的影响 从表5可以看出,0.01 mol/L的Na+、K+和Ca2+能够在一定程度上提高甜叶菊废渣提取物的抑菌活性,但对不同供试菌抑菌活性的增效作用有差异。对于枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌,3种离子对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的增效作用强弱为K+>Na+≈Ca2+;对于蜡样芽孢杆菌,3种离子对甜叶菊废渣提取物抑菌活性的无增效作用。经Fe2+和Fe3+处理的甜叶菊废渣提取物的抑菌活性显著降低,使其对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性丧失,这可能与甜叶菊废渣提取物中的抑菌成分与Fe2+和Fe3+结合从而降低了其抑菌作用有关[22]。郝淑贤等发现经0.05 mol/L的Fe2+和Fe3+处理的荸荠英提取物的抑菌活性明显提高[23]。与之相反,黄晓敏报道Fe2+的加入使得马尾松针黄酮类物质对枯草芽孢杆菌的抑菌能力降低[24]。吴少辉等报道Fe2+和Fe3+浓度在0～0.01 mol/L的范围内,对南五味子提取物抑菌活性的影响不大,高浓度的Fe2+和Fe3+本身对黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有抑菌活性[22]。因此,一些研究报道Fe2+和Fe3+对样品抑菌活性的增效作用[23]可能与其本身在高浓度时具有抑菌作用有关。金属离子与甜叶菊废渣提取物中抑菌成分的相互作用机制有待在后期进行深入研究。

表5 金属离子对甜叶菊废渣提取物的抑菌圈直径的影响

3 结论

本文主要研究了甜叶菊废渣提取物的抑菌活性及抑菌稳定性。该提取物以甜菊糖苷生产中的副产物——甜叶菊絮凝废渣为原料,经酸性丙酮提取和乙酸乙酯萃取获得,其主要成分为绿原酸类(48.5%)和黄酮类(9.7%)物质。研究表明,甜叶菊废渣提取物对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌具有良好的抑菌作用,最小抑菌浓度(或最小杀菌浓度)分别为3.13(6.25)、12.5(25)和12.5(12.5) mg/mL,抑菌活性随甜叶菊废渣提取物浓度的增加而增强。甜叶菊废渣提取物中的抑菌成分在酸性条件下抑菌作用较强,并对温度和紫外光具有较好的稳定性,Na+、K+和Ca2+对其抑菌活性有一定的增效作用。与本研究不同,任晓静等对甜叶菊水提取物的抑菌活性和抑菌稳定性进行了研究[4],然而水提取物中的主要成分为甜菊糖苷,是其发挥抑菌作用的主要成分。本研究选用的甜叶菊废渣提取物富含绿原酸和黄酮,可在甜菊糖生产过程中同时获得,能够节省能耗,降低生产成本,并提高甜叶菊的综合利用价值。该甜叶菊废渣提取物经食品加工中常见的热处理和紫外杀菌,仍能极大程度地保留其抑菌活性,作为天然食品防腐剂使用,可通过综合考虑所防治的微生物种类和具体的加工条件,实现延长食品保质期,具有广阔的发展前景。后续研究可对甜叶菊废渣提取物的主要抑菌成分进行鉴定,同时阐明其抑菌机制,并探讨其对食品风味的影响。

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Antibacterial activity and stability ofSteviaRebaudianawaste extract

ZHAO Lei1,LIN Wen-xuan1,CHI Qian1,WANG Cheng-tao1,*,XU Mei-li2,LIAN Yun-he2

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health/Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.Chenguang Biotech Group Co.,Ltd.,Handan 057250,China)

The objective of the study was to evaluate the antibacterial activity and stability ofSteviarebaudianawaste extract.Steviarebaudianawaste extract was obtained from flocculent waste ofSteviarebaudianaby acid acetone and ethyl acetate extraction. The antibacterial activity ofSteviarebaudianawaste extract was evaluated by filter paper diffusion and agar dilution method. The effect of temperature,ultraviolet light,pH and metal ion on the antibacterial activity ofSteviarebaudianawaste extract was also studied. The results showed thatsteviarebaudianawaste extract had antibacterial activity againstStaphylococcusaureus,BacilluscereusandBacillussubtilis,with the minimal inhibitory concentration(or minimum bactericidal concentration)of 3.13(6.25),12.5(25),and 12.5(12.5)mg/mL,respectively. However,it had no antibacterial activity againstEscherichiacoliand Samonella Typhimurium.Steviarebaudianawaste extract still showed good antibacterial activity after heating at 100 °C for 20 min. The antibacterial activity againstBacilluscereusdecreased after ultraviolet light treatment,and eliminated at pH<7.0. Na+,K+and Ca2+increased the antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Bacillus cereus,while Fe2+and Fe3+decreased or deprived its antibacterial activity. In conclusion,Steviarebaudianawaste extract has a broad prospect of development and utilization by using as a natural preservative.

Steviarebaudiana;waste;antibacterial;food-related bacteria

2016-06-13

赵磊(1982-)，女，博士，副教授，研究方向:功能性食品和食品安全,E-mail:zhaolei.cau@gmail.com。

*通讯作者:王成涛(1969-)，男，博士，教授，研究方向:功能性食品和食品生物技术,E-mail:wct5566@163.com。

北京市科技计划项目(Z151100001215008);北京市属高校创新能力提升计划项目(0142132016);北京工商大学大学生科学研究与创业行动计划项目(SJ201601031)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000