缺血性脑卒中患者外周血miRNA生物信息学分析研究▲

胡瑞婷 欧世宁 覃东华 秦 超

(广西医科大学附属民族医院神经内二科，南宁市 530001，E-mail：214846642@qq.com；2 广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁市 530021)

论著·基础研究

缺血性脑卒中患者外周血miRNA生物信息学分析研究▲

胡瑞婷1欧世宁1覃东华1秦 超2

(广西医科大学附属民族医院神经内二科，南宁市 530001，E-mail：214846642@qq.com；2 广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁市 530021)

目的 应用生物信息学技术分析缺血性脑卒中患者外周血中微小RNA(miRNA)的靶基因及其功能、在疾病中的作用。方法 在GEO数据库中检索缺血性脑卒中基因芯片数据，并利用生物信息学工具筛选差异表达的miRNA，对差异表达的miRNA进行靶基因预测分析，对miRNA靶基因进行生物学功能分析及信号通路分析，最后构建miRNA调控网络和miRNA靶基因调控网络。结果 检索到芯片数据GSE55937，筛选得到50个差异表达的miRNA。筛选出的miRNA的靶基因的合集共7 557个。这些靶基因的功能主要为DNA依赖转录、DNA依赖转录调节等，主要分布在丝裂原活化蛋白激酶信号通路、肿瘤信号通路等信号通路。miRNA功能的调控分析及miRNA靶基因调控网络图提示，人类miRNA(hsa-miR)-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p中心度最高。结论 缺血性脑卒中患者外周血中存在差异性表达的miRNA，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p与缺血性脑卒中的发病密切相关。

缺血性脑卒中；微小RNA；生物信息学

缺血性脑卒中为临床常见的疾病，多种相关基因的表达在该病的发生发展中起到重要的作用[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由20～24个核苷酸组成的内源性非编码RNA，通过与靶基因的mRNA配对形成沉默复合体，进而诱发靶基因mRNA降解或抑制靶mRNA翻译，从而在转录后水平对基因转录进行负调控[2]。目前国外已有缺血性脑卒中全基因组芯片研究报告[3-4]，但这些研究仅对芯片数据集进行差异表达分析。为深入探讨这些数据的价值，本文通过BioConductor和R统计软件，运用生物信息学方法筛选差异表达的miRNA，并对这些差异表达的miRNA进行靶基因预测，在此基础上进行生物学功能、信号通路富集分析，最后进行miRNA功能的调控分析和构建miRNA靶基因的调控网络，揭示与缺血性脑卒中相关的miRNA的生物学功能。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载卒中患者miRNA表达芯片数据。数据集均须符合以下3个条件：(1)数据集来自全基因组miRNA表达芯片；(2)包含有卒中患者与正常对照；(3)数据包含完整的芯片数据或标准化后的数据。

1.2 差异表达miRNA的筛选 在R软件(3.2.1版本)环境下，使用Bioconductor(3.1版本)中的limma软件包对原始数据进行背景校正、标准化和log2转换。以P<0.05、倍性变化>1.2倍为阈值进行差异表达miRNA的筛选。

1.3 miRNA靶基因预测分析 分别采用miRanda(www.microrna.org/)和TargetScan(www.targetscan.org/)网站对筛选出来的差异表达miRNA进行靶基因预测分析，再取两个网站得到的共同靶基因进行后续分析。

1.4 生物学功能分析和信号通路分析 对筛选出来的差异表达miRNA提交到DAIVD网站(https://david.ncifcrf.gov/)进行生物学功能(GeneOntology，GO)分析。利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)网站(http://www.kegg.jp/)对差异表达miRNA的靶基因进行信号通路分析。

1.5 miRNA功能的调控分析 采用GCBI网站(www.gcbi.com.cn/gclib)中的miRNA功能模块进行分析。通过miRNA与显著性GO之间的间接关系，来构造GO与miRNA的关系邻接矩阵，从而形成相互作用网络，并通过定量化分离出具有核心调控作用的miRNA，并发现多种miRNA集中调控的核心基因功能。

1.6 miRNA靶基因的调控网络 采用GCBI网站(www.gcbi.com.cn/gclib)中的miRNA靶基因模块进行分析。用miRNA与靶基因之间的靶向调控关系来建立miRNA-gene作用网络。通过基因与miRNA的属性关系建造基因与miRNA的邻接矩阵，从而形成相互作用网络。用节点的连通度来表示节点的重要程度，用来衡量miRNA对周围的基因的贡献程度，或基因对周围的miRNA的贡献程度。

2 结 果

2.1 GSE芯片数据特征 经检索GEO数据库，得到GSE55937芯片数据集，该芯片用于检测缺血性脑卒中患者与合并有脑血管风险患者外周血miRNA表达水平[5]。该研究共检测了48个样本，缺血性卒中患者和脑血管风险患者外周血样本各24例，其采用Affymetrix Multispecies miRNA-3 Array平台。

2.2 差异表达miRNA检测 通过R软件分析，经过log2校正和质量控制分析后，去除不合格样本结果，该组芯片得到50个差异表达miRNA，其中上调miRNA 41个，下调miRNA 9个，包括人类miRNA(homo sapiens-miRNA，hsa-miR)-409-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-371b-5p。前10个差异表达miRNA的情况见表1。

表1 前10个差异表达miRNA

2.3 miRNA靶基因预测 对差异表达的miRNA经miRanda和TargetScan软件预测，取交集共得到7 557个靶基因。

2.4 miRNA靶基因功能分析和信号通路分析 对7 557个miRNA的靶基因进行功能分析发现，这些靶基因的功能主要集中在DNA依赖转录、DNA依赖转录调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子正调节等功能上。在KEGG数据库进行信号通路发现，这些靶基因主要分布在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、肿瘤信号通路、肿瘤蛋白聚糖信号通路等。见表2。

表2 差异表达miRNA靶基因生物学功能和信号通路

注：PI3K-Akt为磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶(protein kinase B，Akt)。

2.5 miRNA功能性网络调控分析 通过构建差异表达miRNA与细胞生物学功能的网络，分析发现，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等miRNA的中心度最高。见表3。

表3 miRNA功能性网络调控分析

2.6 miRNA靶基因网络调控分析 用mRNA与靶基因之间的靶向调控关系来建立miRNA-gene作用网络。结果显示hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等对周围的靶基因的中心度最高。见图1。

图1 miRNA靶基因网络图

注：红色代表上调，蓝色代表下调；方形代表miRNA，圆形代表靶基因；连线代表miRNA与靶基因存在调控关系。

3 讨 论

卒中是当今威胁人类生命的主要疾患之一，其发生率和死亡率一直高居不下，而缺血性脑卒中是卒中最常见的类型。缺血性卒中的发病原因复杂，但大多数是由于动脉粥样硬化继发动脉闭塞或狭窄导致的。如何有效地保护脑神经、促进受损的神经细胞功能恢复一直是研究的热点，但迄今为止该问题仍未得到较好的解决，其中一个重要的原因就是是对该病发生发展机制仍未完全了解[6]。现代医学研究表明，单独用某一基因或信号通路的结果难以完全解释某疾病发生、发展过程。高通量的生物学检测技术，即基因芯片检测技术可以一次性获取大量的基因表达信息，通过生物信息方法分析这些基因表达信息，可以了解活体细胞内生物分子及其间的相互作用，从而找出疾病发生过程中的关键因子，为临床治疗设计靶点提供依据[7]。

miRNA以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区。其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起到多种调控作用。miRNA精细调节基因的时序性表达。在中枢神经系统的发育、成熟和多种神经生理过程中，miRNA起着关键的调控作用[8]。最近的研究表明，急性缺血性脑卒中患者发病24 h内外周血浆中即存在差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA可能与缺血性卒中早期的缺血缺氧应激、血脑屏障破坏、早期再灌注损伤等有关，也有可能作为缺血性卒中早期干预新的治疗方向和靶点[9]。有学者对16例缺血性卒中不同亚型患者的基因芯片分析后发现，大动脉粥样硬化性型卒中患者及小动脉闭塞性型卒中患者血浆miRNAs表达谱存在明显差异[10]。

本研究利用GEO数据库中的缺血性脑卒中基因芯片原始数据，并使用软件包分析差异表达的miRNA，根据设定的阈值得到上调miRNA 41个、下调miRNA 9个。通过进一步的生物学功能和信号通路分析发现，差异表达的miRNA主要集中在DNA依赖转录、DNA依赖转录调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子正调节等生物学过程中，主要通过MAPK信号通路、肿瘤信号通路、肿瘤蛋白聚糖信号通路等发挥作用。miRNA发挥生物学作用主要是通过对其靶基因的调控实现的，通过分析这些差异表达miRNA的功能发现，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等miRNA的中心度最高。进一步的miRNA靶基因网络调控分析也表明，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等对周围的靶基因的中心度最高，提示这些miRNA是调控的核心miRNA功能。

总之，本研究利用生物信息学技术筛选出缺血性脑卒中患者差异表达miRNA，分析了这些miRNA的生物学功能和调控通路，并从中找到了具有核心功能的miRNA，为后期实验研究提供数据和基础，也为确定缺血性脑卒中早期诊断标志与新治疗靶位开辟了新的思路。

[1] Silasi G MT,Murphy TH.Stroke and the connectome:how connectivity guides therapeutic intervention[J].Neuron,2014,83(6):1 354-1 368.

[2] Nilsen TW.Mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in animal cells[J].Trends Genet,2007,23 (5):243-249.

[3] Krug T,Gabriel JP,Taipa R,et al.TTC7B emerges as a novel risk factor for ischemic stroke through the convergence of several genome-wide approaches[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(6):1 061-1 072.

[4] Rosell A,Vilalta A,García-Berrocoso T,et al.Brain perihematoma genomic profile following spontaneous human intracerebral hemorrhage[J].PLoS One,2011,6(2):e16 750.

[5] Jickling GC,Ander BP,Zhan XH,et al.microRNA expression in peripheral blood cells following acute ischemic stroke and their predicted gene targets[J].PLoS One,2014,9(6):e99 283.

[6] Liu XS,Chopp M,Zhang RL,et al.MicroRNAs in cerebral ischemia-induced neurogenesis[J].J Neuropathol Exp Neurol,2013,72(8):717-721.

[7] 滕牧洲,马文丽.走近医学研究领域中的基因芯片技术[J].分子诊断与治疗杂志,2014,6(6):361-365.

[8] Tan JR,Koo YX,Kaur P,et al.microRNAs in stroke pathogenesis[J].Curr Mol Med,2011,11(2):76-92.

[9] 仲倩维,马爱军,潘旭东,等.缺血性卒中不同亚型患者血浆miRNAs表达谱变化分析[J].中华神经科杂志,2015,48(2):114-119.

[10]陈 烜,侯玉立,李伟荣,等.血浆miRNAs在急性病理期缺血性脑卒中的表达谱分析[J].中西医结合心脑血管病杂志,2015,13(7):932-934.

Bioinformatics study of microRNA in peripheral blood of patients with ischemic stroke

HURui-ting1,OUShi-ning1,QINDong-hua1,QINChao2

(1TheSecondDepartmentofNeurology,AffiliatedMinzuHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530001,China;2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To analyze the target genes of peripheral blood microRNA(miRNA) in patients with ischemic stroke,and to investigate their function and the role in the disease by bioinformatics analysis.Methods Microarray data of ischemic stroke were retrieved from GEO database,and the miRNAs with differential expression were screened by bioinformatics tools.Then the target genes of miRNAs with differential expression were analyzed.Gene ontology analysis and signal pathway analysis were performed in the target genes of miRNAs.miRNA network and miRNA-targeted gene network were established.Results Data were obtained from GSE55937 and 50 differential expressed miRNA were screened.A total of 7557 target gene sets of screened miRNA were obtained.The functions of these target genes mainly included DNA-dependent transcription and DNA-dependent regulation of transcription,ect.,mainly distributed in mitogen-activated protein kinase signal pathway and cancer signal pathway,ect..miRNA network analysis and miRNA-targeted gene network analysis revealed that homo sapiens-miRNA(hsa-miR)-15a-5p,hsa-miR-106b-5p,hsa-let-7c-5p,hsa-let-7i-5p and hsa-let-7g-5p were cored in the network.Conclusion Differential expressed miRNAs exist in the peripheral blood of patients with ischemic stroke,and hsa-miR-15a-5p,hsa-miR-106b-5p,hsa-let-7c-5p,hsa-let-7i-5p and hsa-let-7g-5p are closely associated with the pathogenesis of ischemic stroke.

Ischemic stroke,MicroRNA,Bioinformatics

国家自然科学基金(81360191)；广西医药卫生科研课题(Z2015105)

胡瑞婷(1985～)，女，硕士，主治医师，研究方向：脑血管病诊治。

R 743.3

A

0253-4304(2016)06-0759-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.02

2016-01-25

2016-04-07)