绒毛细胞核型分析在胚胎停育中的应用观察*

成志汤素环谭卫荷佘芹陈玉铃



绒毛细胞核型分析在胚胎停育中的应用观察*

成志①汤素环①谭卫荷①佘芹①陈玉铃①

【摘要】目的：研究胚胎停育的原因并探讨绒毛细胞核型分析在妊娠指导及胚胎停育中的应用价值。方法：选取2014年1月-2015年12月本院收治的胚胎停育患者手术清宫绒毛组织标本100例，作为研究对象。对所有无菌绒毛标本进行长期细胞培养、染色体制备与细胞核型分析，同时分析患者胚胎停育产生的原因，研究绒毛细胞核型在妊娠指导及胚胎停育中的应用价值。结果：100例胚胎停育绒毛组织标本经长期细胞培养成功95例，培养成功率达95.00%，培养成功标本中检出异常核型34例，异常率为35.79%，异常核型分类中常染色体三体标本16例（47.06%），三倍体标本7例（20.59%），四倍体标本3例（8.82%），嵌合体标本3例（8.82%），性染色体单体标本3例（8.82%），结构异常2例（5.88%），其中常染色体三体异常检出率明显高于其他异常核型检出率，差异有统计学意义（P＜0.05）；绒毛细胞核型正常标本61例中，男性核型25例（40.98%），女性核型36例（59.02%），性别核型构成比比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：胚胎绒毛细胞核型异常是导致胚胎停育的主要原因之一，并且异常核型以常染色体三体最为常见，通过分析绒毛染色体核型有助于明确患者胚胎停育的原因，可对患者下次妊娠提供合理的指导，具有临床应用及推广价值。

【关键词】绒毛细胞核型分析； 胚胎停育； 影响因素； 研究意义

①广东省清远市人民医院 广东 清远 511518

First-author’s address：Guangzhou Medical University Sixth Affiliated Hospital Qingyuan People’s Hospital，Qingyuan 511518，China

胚胎停育是一种临床上较为少见的妊娠恶性结局，随着近年来环境的恶化以及生活饮食习惯的转变，我国胚胎停育发生率呈递增趋势［1］。病理生理学分析认为胚胎停育是因多种因素如孕卵缺陷、母体不利于妊娠等复杂因素导致的一种妊娠早期胚胎死亡的病理性妊娠，虽然临床上未完全明确导致胚胎停育的原因，但多数学者认为遗传、免疫、激素、生殖感染、内分泌功能等因素是导致胚胎停育的主要原因，并且以遗传因素最为常见，尤其是胚胎染色体异常已被广泛认可作为胚胎停育的主要诱发因素［2］。正常生理与遗传性角度中，绒毛细胞作为胚胎外胚层细胞，其具有与正常胚胎组织完全相同的生物遗传形状，因此通过采集胚胎停育患者绒毛细胞并进行染色体核型分析可获取胚胎细胞的遗传性状，进而直接分析遗传因素对胚胎停育的影响［3］。本组研究采用长期细胞培养法，通过对100例胚胎停育绒毛细胞标本进行细胞培养，分析培养成功绒毛核型进而研究绒毛细胞核型分析在妊娠指导及胚胎停育中的应用价值。现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月-2015年12月本院收治的胚胎停育患者手术清宫绒毛组织标本100例，作为研究对象。患者年龄19～41岁，平均（28.6±3.2）岁，孕周8～12周，平均（10.5±1.2）周，其中高龄妊娠13例，试管婴儿2例，存在稽留史患者9例，双胎妊娠4例。纳入标准：所有患者对本组研究完全知情同意，已通过本院伦理道德委员会审核；均明确为稽留流产；超声检查明确胚胎停止发育，无原始血管波动，无胚芽［4］。排除标准：精神疾病患者；性疾病患者；家族遗传史；免疫功能异常；凝血机制障碍［5］。

1.2研究方法 所有患者均因稽留流产手术清宫，术中无菌采集绒毛组织5～15 mg。采用长期绒毛细胞培养法培养100例绒毛细胞标本，采用改良组织培养法与消化培养法共同培养。（1）改良组织培养法：首先将绒毛组织取出后放置于无菌细胞培养皿中，采用注射器抽取5 mL生理盐水冲洗绒毛并将绒毛粘连的血凝块及其他杂志彻底清除，采用无菌眼科剪修剪绒毛支，以分芽多，末端粗钝呈仙人掌状或鹿角状的绒毛为最佳，后采用无菌手术刀片切碎绒毛组织，切碎后组织块大小以能被5 mL注射器吸取为宜，5 mL GIBC羊水培养液注入细胞培养皿中，采用巴斯德吸管吸取含有细小绒毛组织碎块的培养液移入培养瓶中，每次培养2瓶，将处理后的绒毛组织培养瓶置5% CO2培养箱中静置培养，培养7 d后观察是否存在绒毛组织细胞在培养瓶的底部发生贴壁生长，当发现存在有梭形和圆形细胞时，可更换绒毛细胞培养瓶中的新鲜培养液继续进行细胞培养。（2）消化培养法：将绒毛组织从试管中取出，置放于无菌培养皿中，用注射器抽取5 mL生理盐水，洗涤绒毛，去除肉眼可见的血液凝块和杂质，用无菌剪刀剪下绒毛枝，一般以分芽多，末端粗钝呈仙人掌状或鹿角状的绒毛为最佳，用无菌剪刀把绒毛组织剪碎，加入生理盐水5 mL，用巴斯德吸管吸取含有细小绒毛组织碎块的生理盐水放入15 mL无菌离心管中，1800转离心10 min，吸去上清，加入1 mL胶原酶和1 mL胰酶，吹打60～80次，放入培养箱中消化10 min左右，取出加入1 mL小牛血清，吹打均匀，终止消化，1800转离心10 min钟，弃上清，加入10 mL GIBCO羊水培养液，接种于两个细胞培养瓶中，置于5% CO2培养箱静置培养7 d，观察有梭形和圆形细胞时，换新鲜培养液继续培养。（3）培养瓶内换液后见绒毛细胞上皮样或成纤维样细胞生长良好，出现的圆形细胞数量较多就可以收获细胞。收获细胞前需向培养瓶中加如秋水仙素3滴，并放置于培养箱中继续培养2～3 h，取出培养瓶并把培养液倒入离心管中，在每个培养瓶中加入2 mL 37℃预温EDTA-胰酶，置于37 ℃水浴箱中6～8 min，加入原保留的培养液终止消化，将离心管进行高速离心处理，抽取并移除离心管中上清液，向离心管汇总加入4 mL已预温到37 ℃的低渗液，置于水浴箱中低渗处理10 min，加入1 mL 3∶1的甲醇与冰醋酸固定液预固定1次，离心后弃上清再固定两次，在冰片上滴片，75 ℃烤片3 h，胰酶显带，Gimsa染色，镜下观察并计数20个分裂相，配对分析5个核型，发现嵌合则加大计数量至100个细胞。

1.3观察指标 记录培养成功标本数，并统计分析培养成功标本的绒毛细胞核型，根据是否异常进行分组，异常核型分析染色体异常类型，正常核型分析胚胎性别，采用统计学处理分析胚胎停育常见绒毛细胞异常核型及正常核型性别差异。

1.4统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 X2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1绒毛细胞长期培养结果 100例胚胎停育绒毛组织标本经长期细胞培养成功95例，培养成功率达95.00%，培养成功标本中检出异常核型34例，异常率为35.79%，检出正常核型61例，正常率为64.21%。

2.2绒毛细胞异常核型类型分析 对绒毛细胞异常核型检出的34例标本进行染色体异常类型分析可知，常染色体三体异常检出率为47.06%（16/34），明显高于三倍体的20.59%（7/34）、四倍体8.82% （3/34）、嵌合体8.82%（3/34）、性染色体单体8.82% （3/34）及结构异常5.88%（2/34）等类型检出率，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3绒毛细胞正常核型性别分析 分析绒毛细胞正常核型检出的61例性别构成情况可知，绒毛细胞正常核型女性核型构成比为59.02%（36/61），明显高于男性核型的40.98%（25/61），差异有统计学意义（X2=3.169，P=0.032）。

3　讨论

胚胎停育是一种妊娠早期胚胎死亡的病理性妊娠，常作为一种恶性的女性妊娠结局被临床所重视［6］。目前临床通过实验研究认为导致胚胎停育的主要因素为遗传因素、免疫因素、环境因素与内分泌因素，其中遗传因素是导致胚胎停育的主要因素，有关调查结果显示胚胎停育中50%～60%的患者因胎儿染色体异常所致，而有研究表明因遗传因素导致的胚胎停育不仅影响本次妊娠结局，同时可对患者下次或以后的妊娠均产生不同程度的影响，因此明确胚胎停育的原因及有效的干预对指导下次合理妊娠具有重要意义［7］。

本组研究结果显示，95例培养成功的绒毛细胞标本中有34例标本检出绒毛细胞核型异常，检出异常率达35.79%，同时对于核型异常类型的分析结果显示，常染色体三体异常检出率明显高于三倍体、四倍体、嵌合体、性染色体单体、结构异常检出率；而在核型正常的61例绒毛细胞标本中，女性核型标本构成比明显高于男性核型，差异有统计学意义（P＜0.05）。本组研究结果表明绒毛细胞核型异常是导致胚胎停育的主要原因，并且异常核型中以常染色体三体异常最为常见，而在正常核型胚胎性别分析中女性胎儿较男性胎儿更易发生胚胎停育。

通过实验回顾分析可知，绒毛组织是人类受精卵正常发育过程中的胎盘附属物，其与正常胚胎具有高度相同的生物遗传性，即绒毛组织的染色体结构与胎儿的染色体结构、生物遗传特性等基本一致，并且绒毛组织具有较强的细胞分裂能力，通过手术采集绒毛细胞后可通过相应的体外培养手段获取足够的处于分裂中期的绒毛细胞，进而通过分析培养后的绒毛细胞进行胚胎遗传学研究［8］。

在本组研究中采用的是长期绒毛细胞培养法，目前临床上对于绒毛细胞染色体等遗传学分析常用的细胞培养法有直接培养法与长期培养法，传统的直接培养法具有方便、快捷、便宜、易操作的应用特点，对于培养条件及实验室水平的要求并不高，适用于基层医院推广应用，但直接绒毛细胞培养法无法直接获取中期绒毛细胞染色体分裂象，同时绒毛细胞培养成功率较低［9］。而长期细胞培养法是一种培养时间较长、培养过程较为复杂的绒毛细胞培养法，主要通过组织块培养与消化培养法获取中期绒毛细胞染色体分裂相，但长期绒毛细胞培养法对实验室条件、仪器要求较为严格，培养条件苛刻，操作步骤较为复杂，培养周期较长且培养费用较为昂贵，但由于其可获取中期绒毛细胞及较高的成功率而被临床所重视［10-11］。目前国外常规产前诊断技术已经包括绒毛细胞染色体的长期培养，但在我国仅有部分仪器较为先进、实力较强的产前诊断中心才可进行绒毛细胞的长期培养将其作为常规的产前诊断技术，而一般的医院对产妇进行产前检查主要依赖于对绒毛细胞的直接分析或采用直接法进行培养［12］。

研究结果显示，绒毛细胞染色体的长期培养及染色体性状分析，对于胚胎停育标本绒毛细胞遗传物质，即染色体核型的鉴别与诊断中具有较高的临床应用价值。在本组研究中的100例胚胎停育绒毛细胞标本中，采用长期培养法成功培养95例，培养成功率达95.00%，表明采用长期培养法，包括改良组织块培养法以及消化培养法，能够建立一种培养结果更为稳定，培养成功率更高，操作更为简便的绒毛组织细胞染色体检查方法，能够缩短长期培养法的培养周期，并且保障绒毛细胞中期分裂相的培养成功率，可为临床诊治提供可靠的实验依据，以便对类似患者妊娠进行遗传咨询、产前诊断和及时适当处理［13］。而对于绒毛细胞异常核型构成分析结果显示，绒毛细胞常染色体三体异常核型最为常见，通过实验回顾分析认为，在正常遗传物质染色体异常中，主要的表现形式为移位、倒置、断裂等结构异常以及单倍体、三倍体及多倍体等数目的异常，而在胚胎停育中染色体数目异常是主要的绒毛细胞异常核型类型，其中又以常染色体三体异常最为常见，分析其原因认为正常胚胎在性细胞成熟的过程中，以及受精卵的早期卵裂过程中，由于多种遗传因素导致胚胎染色体未发生正常的分离，进而导致染色体数目的异常，而染色体增多一条或增多两条等等便可导致染色体三体、三倍体、四倍体等数目异常的发生［14-15］。而对于正常绒毛细胞核型胚胎停育标本中，性别比例的差异表明女性胚胎更易发生胚胎停育，这可能与性染色体的遗传性状有关，同时有学者认为，正常绒毛细胞核型表明胚胎遗传性状的正常，可初步排除遗传因素对胚胎停育的影响，因此对于绒毛细胞核型正常的胚胎停育患者应积极查找其他因素，通过对患者进行多方面的检查明确是否因内分泌、环境、免疫等方面的影响因素导致胚胎停育，进而在下次或以后的妊娠中避免这些影响因素［16］。

本组研究也直接表明，产前检查中行绒毛细胞培养及遗传学细胞核型分析对保证妊娠安全的重要作用，通过绒毛细胞培养及绒毛细胞核型分析可判断胚胎染色体是否发生异常，对于发生异常的绒毛细胞核型，进一步分析其绒毛细胞核型异常类型，重点警惕绒毛细胞染色体数目异常，尤其是常染色体三体异常绒毛细胞，其胚胎停育发生率较高，应及时给予患者干预或终止妊娠，以免发生恶性妊娠结局并且对下一次妊娠需接受产前诊断明确胚胎是否存在染色体异常。对于已发生胚胎停育的患者，若检出绒毛细胞异常核型应进行进一步的患者遗传学分析，明确导致绒毛细胞核型即胚胎核型异常的原因，及时治疗干预，避免再次妊娠时患者发生胚胎停育；正常绒毛细胞胚胎停育的患者则需通过免疫因素、内分泌因素、环境因素等进行多方面分析，明确导致胚胎停育的非遗传影响因素，进而通过针对性干预措施降低再次妊娠的胚胎停育发生率［17-20］。

综上所述，胚胎绒毛细胞核型异常是导致胚胎停育的主要原因之一，并且异常核型以常染色体三体最为常见，通过分析绒毛染色体核型有助于明确患者胚胎停育的原因，可对患者下次妊娠提供合理的指导，具有临床应用及推广价值。

参考文献

［1］刘丽娜，张丽颖.胚胎停育高危因素和并发症的探索［J］.疑难病杂志，2015，14（2）：214-217.

［2］钟萍.妊娠失败早期诊断方法的研究进展［J］.中国医学创新，2010，7（10）：187-189.

［3］马芳芳，王厚照，刘芳.厦门地区64例胚胎停育绒毛染色体分析［J］.中国优生与遗传杂志，2015，23（2）：40-41.

［4］胡浩梅.胚胎停育与染色体异常的相关研究［D］.天津：天津医科大学，2014.

［5］付娟娟，杨晨晨，胡小萍.FISH检测孕早期胚胎停育和自然流产绒毛染色体异常的应用研究［J］.新疆医科大学学报，2015，38（5）：612-614.

［6］潘丽华，韩华，贾艳敏，等.自然妊娠和辅助生殖技术妊娠孕妇胚胎停育绒毛染色体异常的研究［J］.宁夏医科大学学报，2014，36（12）：1353-1355.

［7］韩华，李萍艳，杜鹏，等.FISH检测染色体数目异常在胚胎停育患者中的应用［J］.宁夏医学杂志，2014，36（11）：988-990.

［8］王厚照，马芳芳.ART术后妊娠与自然妊娠自然流产的绒毛细胞染色体分析［J］.中国优生与遗传杂志，2015，23（2）：23-24.

［9］谢晔玲，丁玲，施如霞，等.子宫肌壁间妊娠5例临床分析［J］.中国医学创新，2009，6（33）：206-207.

［10］张玉萍，杨欣艳，何春久，等.佳木斯地区125例胚胎停育患者绒毛细胞染色体分析［J］.中国优生与遗传杂志，2012，20（8）：54.

［11］张燕，张凤，周亚东，等.自然妊娠和ART妊娠早期流产绒毛细胞遗传学检查的临床应用价值［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2012，32（7）：937-941.

［12］王云，孙巧霞，随璐.547例胚胎停育妇女相关危险因素分析［J］.中外医学研究，2015，13（21）：56-58.

［13］张玉萍，杨欣艳，孙盛梅，等.佳木斯三江地区孕早期胚胎停育196例染色体核型分析［J］.黑龙江医药科学，2015，38 （4）：123-125.

［14］刘安娜.厦门地区81例胚胎停育患者绒毛组织细胞遗传学分析［J］.中国优生与遗传杂志，2014，22（11）：64-65.

［15］张福利，郭艺红，苏迎春，等.IVF-ET后胚胎停育患者绒毛染色体异常的影响因素［J］.生殖与避孕，2014，34（9）：729-734.

［16］张明，孟和宝力高，郭兰英，等.9号染色体臂间倒位1例［J］.中国医学创新，2010，7（35）：115.

［17］杨金金.miRNA-126、Ets-1和MMP-9在胚胎停育绒毛组织中的表达研究［D］.长沙：中南大学，2013.

［18］李伟，郝娜，周京，等.胚胎停育绒毛染色体培养与分析［J］.中国优生与遗传杂志，2010，18（10）：48-50.

［19］徐雪琴，李焕铮，林小玲，等.温州地区110例早孕胚胎停育绒毛染色体核型分析［J］.中国优生与遗传杂志，2012，20 （12）：54-55.

［20］马玲利，丛林，袁静.100例早孕胚胎停育绒毛染色体核型分析［J］.中国妇幼保健，2011，26（26）：4104-4105.

Application Observation of Hair Cells Karyotype Analysis in the Embryo Damage

CHENG Zhi，TANG Su-huan，TAN Wei-he，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：129-132

【Abstract】Objective：To study the reasons of embryo damage and discuss the application value of hair cells karyotype in the embryo damage and pregnancy guidance.Method：From January 2014 to December 2015，100 cases of embryo damage patients’ curettage villi tissue samples，which admitted in our hospital were selected as the research objects.All sterile villi samples were given the long-term cell culture，chromosome preparation and karyotype analysis.The cause of patients with embryo damage was analyzed at the same time.The application value of hair cells karyotype analysis in the embryo damage and pregnancy guidance was analyzed.Result：A total of 100 cases of embryonic damage villi tissue samples by cell culture for a long time，95 cases of success，the success rate was 95.00%.Development successful specimens’ detected abnormal karyotype in 34 cases，the abnormal rate was 35.79%，in the abnormal karyotype classification，triplox specimens 16 cases （47.06%），triploid specimens 7 cases （20.59%），tetraploid specimens 3 cases （8.82%），chimeric specimens 3 cases （8.82%），sex chromosome single specimens 3 cases （8.82%），abnormal structure 2 cases （5.88%）.Abnormal autosomal triplox detection rate was much higher than other abnormal karyotype detection rate，the difference was significant statistically significant （P＜0.05）.For the 61 cases hair cells karyotype normal specimens，the male karyotype 25 cases （40.98%），female karyotype 36 cases （59.02%），sex karyotype composition had more significant differences，the difference was significant statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：Embryo villus cell abnormal karyotype is one of the main cause of the embryonic damage，and abnormal karyotype autosomal triplox is the most common，through the analysis of hair cells karyotype will help to clear the reason of embryonic damage patients，which can provide reasonable guidance on the next pregnancy patients and has clinical application and popularization value.

【Key words】Hair cells karyotype analysis； Embryo damage； Influencing factors； Research significance

*基金项目：清远市科技计划项目（00161751320722022）

通信作者：成志

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.037

收稿日期：（2016-01-10） （本文编辑：蔡元元）