基于多靶点防治AD策略的候选新药脑智复的药理作用及其机制研究*

艾佳晨，廖应养，熊静悦，肖 英，石依坤，唐大轩，张 莉，谭正怀△

(1.成都中医药大学药学院 610072；2.四川省中医药科学院药理毒理研究所，成都 610041； 3.石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司，石家庄 050035)

基于多靶点防治AD策略的候选新药脑智复的药理作用及其机制研究*

艾佳晨1,2，廖应养3，熊静悦2，肖 英1,2，石依坤1,2，唐大轩2，张 莉2，谭正怀2△

(1.成都中医药大学药学院 610072；2.四川省中医药科学院药理毒理研究所，成都 610041； 3.石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司，石家庄 050035)

目的 评价脑智复多靶点防治阿尔茨海默病(AD)的作用。方法 雌性小鼠去势后30 d，海马内注射Aβ1-42和鹅膏蕈氨酸(IBO)以复制AD模型，次日将造模小鼠分为模型组、脑智复低剂量组、脑智复中剂量组、脑智复高剂量组及吡拉西坦组并相应给药，每天灌胃1次，连续4周，另设假手术组(对照组)进行跳台、Morris水迷宫及生化指标的检测。结果 与对照组比较，模型组小鼠跳台试验中的潜伏期显著缩短(P<0.05)，错误次数增加(P<0.05)，在水迷宫中寻找逃逸平台的逃避潜伏期延长(P<0.05)，进入逃逸平台的次数减少(P<0.05)，在逃逸平台周围游泳的路程、在有效区域内的游泳时间及路程减少(P<0.05);脑组织的丙二醛水平明显升高，乙酰胆碱水平及超氧化物歧化酶活力明显下降(均P<0.05)。脑智复高、中剂量组中上述指标显著改善。结论 脑智复具有体内多靶点防治AD的作用。

阿尔茨海默病；脑智复；Aβ1-42；鹅膏蕈氨酸

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种进行性记忆和认知功能损伤为特征的退行性神经系统疾病[1]。临床主要表现为进行性认知障碍。病理学主要表现为老年斑大量出现、神经原纤维缠结及神经元缺失变性等[2]。流行病学调查表明，我国有AD患者约600万，预计至2020年，我国的AD患者将达到2 000万人[3]，目前全球医药工作者都在积极寻找能有效防治AD的药物或方法。脑智复以具有良好抗氧化作用的灯盏乙素为母体，经过系列结构加工、修饰，使其同时具有良好的抗氧化作用、抑制胆碱酯酶活性、金属络合作用，抑制Aβ的聚集等[4-6]，但其在体内是否同样具有良好的抗AD作用，本文就此问题进行探讨。

1 材料与方法

1．1 材料 实验动物均为SPF级昆明种小鼠[四川省中医药科学院提供，生产合格证号SCXK(川)2013-19号]。DW-2000脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)；Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)；全波长酶标仪(Thermo公司)；脑智复，由四川大学华西药学院邓勇教授课题组提供；Aβ1-42(Sigma公司)；鹅膏蕈氨酸(IBO,Sigma公司)；吡拉西坦片(华中药业股份有限公司，批号20120513)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱(ACh)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及给药 SPF级昆明种雌性小鼠80只，18～22 g，适应性喂养2 d后，用水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠，按照Hruska等[5]做法稍有改进，除假手术组(对照组)小鼠仅切除卵巢附近的脂肪外，其他各组小鼠均进行双侧卵巢摘除手术。卵巢摘除手术4周后，进行神经毒性造模：Aβ1-42粉末0.2 mg溶于200 μL无菌的生理盐水中，浓度为1 μg/μL，混匀，37 ℃恒温箱孵育1周，使其转为凝聚态，取IBO 0.1 mg溶于其中，配制成Aβ1-42和IBO的混合液。运用脑立体定位仪在小鼠大脑海马区(以前囟后3 mm,中线右旁开2 mm，深2 mm为坐标)注射Aβ1-422 μL/只，次日将造模小鼠分为模型组、吡拉西坦组(阳性对照，800 mg/kg)、脑智复高剂量组(脑智复18 mg/kg)、脑智理智中剂量组(脑智复6 mg/kg)、脑智复低剂量组(脑智复2 mg/kg)，后4组灌胃给药，每日1次，连续4周，模型组及对照组则给与等体积0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。给药3周后，进行跳台和Morris水迷宫实验。末次给药后24 h，取脑组织测定SOD、MDA、ACh水平。

1.2.2 跳台实验 于给药3周后进行跳台试验，将动物放入反应箱内适应3 min，然后立即通以36 V交流电。训练5 min，并记录每次小鼠受到电击的次数(错误次数)，并由此作为学习成绩。24 h后进行测试，每只小鼠测定 5 min，记录小鼠第1次跳下平台的潜伏期及5 min内的错误次数。

1.2.3 Morris水迷宫实验 跳台实验结束后，采用Morris水迷宫系统测定小鼠的学习记忆能力。水池直径120 cm，高60 cm，平台直径12 cm。实验前将水池分为1、2、3、4 4个象限，然后将安全平台置于其中一个象限内，向水池内注入水，水温(23±2)℃，加入适量奶粉，使水池成为不透明的白色。(1)定位航行实验：隐藏平台，使水面没过平台2 cm，将小鼠进行隐藏平台实验，并记录90 s内小鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。允许动物90 s内找到平台，并在平台上保持10 s，若动物在入水游泳90 s以内仍未能找到水池中的平台或未能爬上平台时,则将动物引导置于平台上站立保持10 s,动物每天训练3次，连续3 d。(2)空间探索实验：定位航行试验结束24 h后，撤除站台。然后任选一相同入水点将小鼠放入水中，记录小鼠在90 s内的游泳路径，记录有效区域运动时间、有效区域运动距离、有效区域进入逃逸平台次数等。

1.2.4 生化指标 将脑组织用生理盐水制成10%的组织匀浆，按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书测试MDA、SOD、ACh水平。用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。

2 结 果

2.1 跳台实验结果 由表 1可见，在跳台实验中，与对照组比较模型组小鼠的潜伏期明显缩短，错误次数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，吡拉西坦组，脑智复高剂量、中剂量组小鼠潜伏期、错误次数显著延长，差异有统计学意义(P<0.05)。脑智复低剂量组亦可显著延长痴呆小鼠潜伏期，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但其减少错误次数的作用较弱，与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 水迷宫实验结果 由表2可见，模型组小鼠无论在定向航行还是空间探索实验中找到逃逸平台的潜伏期均明显长于对照组(P<0.05)，各药物组均可显著缩短痴呆小鼠找到逃逸平台的潜伏期，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。由表3可见，在空间探索实验中，模型组小鼠进入逃逸平台次数及在平台周围游泳的路程均明显少于对照组(P<0.05)，各药物组均能显著增加痴呆小鼠进入逃逸平台次数及在逃逸平台周围游泳的路程，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。脑智复高、中剂量小鼠进入逃逸平台的次数与吡拉西坦组比较明显增多(P<0.05)。

表1 脑智复对AD小鼠在跳台实验中各项指标的影响(±s)

a:P<0.01，b,P<0.05,与模型组比较。

表2 脑智复对AD小鼠在定向航行及空间探索实验找到逃逸平台逃逸潜伏期的影响(±s)

d1、d2、d3、d4分别为水迷宫试验第1、2、3、4天；b：P<0.01，a：P<0.05，与模型组比较。

由表4 可见，在空间探索实验中，模型组小鼠在有效区域内的游泳时间及路程均明显少于对照组(P<0.05)。吡拉西坦组也可一定程度增加有效区域内的运动时间及路程，但与模型组比较差异无统计学意义(P<0.05)，而脑智复各剂量组均能明显增加AD小鼠在有效区域内的游泳时间及路程(P<0.05)。与吡拉西坦组相比，脑智复各剂量组在有效区域内的游泳路程明显增加(P<0.05)。

表3 脑智复对AD小鼠进入逃逸平台的次数及在其周围游泳路程的影响(±s)

a:P<0.05,与模型组比较；b:P<0.05，与吡拉西坦组比较。

2.3 生化指标变化 如表 5 所示，与对照组比较，模型组脑组织MDA水平明显升高，SOD活力明显下降(P<0.05)。与模型组比较，脑智复高剂量组MDA水平显著降低，脑智复中剂量组ACh水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 脑智复对AD小鼠在有效区域内游泳时间及路程的影响 (±s)

a：P<0.05,与模型组比较;b:P<0.05，与吡拉西坦组比较。

表5 脑智复对AD小鼠脑组织中SOD、MDA、ACh水平的影响(±s)

a：P<0.05,b：P<0.01,与模型组比较。

3 讨 论

AD发病机制复杂、涉及诸多假说，包括Aβ沉积学说、胆碱能神经异常假说、氧化应激与自由基损伤假说、tau蛋白磷酸化学说及雌激素缺乏学说等[6]。目前已经上市的AD治疗药物大部分属于单靶向药物，可以一定程度缓解轻度、中度的AD症状，但不能阻止或者逆转AD的进一步发展。近年来研究者尝试多靶点治疗AD，以期找到更有效的药物[7]。

本课题组采用去势小鼠单侧海马内注射Aβ1-42和IBO的混合液导致的复合模型，以模拟Aβ沉积、胆碱能神经损伤及雌激素缺乏等多种因素复合引起的AD。结果表明，在去势小鼠海马注射Aβ1-42和IBO后，小鼠的学习、记忆能力均明显降低，小鼠脑组织MDA水平明显升高，SOD活力及ACh水平明显下降，这表明侧脑室注射Aβ1-42和IBO及雌激素缺乏诱导氧化应激产生游离的自由基,破坏胆碱能系统，使学习记忆能力下降。基底前脑注射IBO，会破坏脑内胆碱能系统，使胆碱能神经元丢失，破坏胆碱能神经元的功能，或使其功能丧失，降低ACh[8-9]，Aβ1-42或者IBO单独注射仅能使注射部位周边的神经元退化损伤，Aβ1-42和IBO联合注射不仅使注射部位神经元剧烈丢失，还能使海马CA1、CA4区的神经元细胞丢失，这种损伤与IBO有剂量依赖。而且Aβ和IBO联合注射能强烈损伤微管结合蛋白-2的免疫反应[10]。氧自由基增加既是雌激素缺乏的结果[11],也是Aβ的毒性效应之一，增加神经细胞中自由基的浓度，可诱发脂质过氧化，使Ca2+内流，进而使线粒体功能损伤，诱导神经元凋亡。脑组织的氧化应激还可使Aβ斑块的沉积加速，沉积的Aβ斑块可作为活性氧供体从而加剧氧化应激，因此，应用抗氧化剂可以阻断氧化应激和Aβ斑块之间的正反馈[12-13]，进而使得神经元细胞避免受Aβ的毒害。这可能也是本实验发现吡拉西坦对复合因素致AD小鼠具有一定预防作用的重要原因。吡拉西坦是GABA(γ-氨基丁酸)的衍生物，与谷氨酸受体有最大亲和力，可直接激活谷氨酸受体；清除脑内氧自由基，减慢脂质过氧化；抗大脑皮质缺氧，增加氧血流量，促进能量转化，和脑蛋白质合成及促进脑半球间的信息传递，增加脑细胞的能量储存和脑细胞活性，从而改善学习记忆能力，是常用的神经保护剂[14-15]。

本实验中，经过脑智复治疗后，脑组织中的ACh水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，AD小鼠的学习记忆能力明显改善，其学习记忆能力强于吡拉西坦组，提示脑智复在体内同样具有良好的抗氧化作用及抑制胆碱酯酶活性的作用，展示了部分多靶点作用的特性，其他多靶点策略的体现还有待进一步深入研究和评价。

[1]Palmer AM.Neuroprotective therapeutics for Alzheimer′s disease:progress and prospects[J].Trends Pharmacol Sci,2011,32(3):141-147.

[2]Huang YD,Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies[J].Cell,2012,148 (6):1204-1222.

[3]王晶．我国阿尔茨海默病的流行现状及预防措施[J]．亚太传统医药，2011，7(2)：157-158．

[4]SangZ,QiangX,LiY,etal.Design,synthesisand evaluation of scutellarein-O-alkylamines as multifunctional agents for the treatment of Alzheimer′s disease[J].Eur J Med Chem,2015,94:348-366.

[5]Hruska Z,Dohanich GP.The effects of chronic estradiol treatment on working memory deficits induced by combined infusion of beta-amyloid (1-42) and ibotenic acid[J].Horm Behav,2007,52(3):297-306.

[6]Lewis J,Dickson DW,Lin WL,et al.Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP[J].Science,2001,293(5534):1487-1491.

[7]杨云，卞广兴，吕秋军．多靶向抗阿尔茨海默病的研究进展[J]．中国新药志，2008，17(1)：12-20．

[8]张兰，叶翠飞，褚燕琦，等．二苯乙烯苷对鹅膏蕈氨酸致痴呆大鼠模型脑内胆碱能系统的影响[J]．中国药学杂志，2005，10(10)：749-752．

[9]陈民，王晶，陈欢雪．Aβ1-42合并IBO诱导阿尔茨海默病大鼠模型的建立和评价[J]．中西医结合心脑血管病杂志，2010，8(4)：465-467．

[10]Morimoto K,Yoshimi K,Tonohiro T,et al.Co-injection of beta-amyloid with ibotenic acid induces synergistic loss of rat hippocampal neurons[J].Neuroscience,1998,84(2):479-487.

[11]Lean JM,Davies JT,Fuller K,et al.A crucial role for thiol antioxidants in estrogen-deficiency bone loss[J].J Clin Invest,2003,112(6):915-923.

[12]卢继承，林贞贤．白藜芦醇对Aβ致大鼠学习记忆损伤的修复作用[J]．泰山学院学报，2013，35(3)：120-123．

[13]Fukui H,Moraes CT.The mitochondrial impairment,oxidative stress and neurodegeneration connection:reality or just an attractive hypothesis[J].Trends Neurosci,2008,31:251-256.

[14]Cohen S,Müller WE.Effects of piracetam on N-methyl-D-aspartate receptor properties in the aged mouse brain[J].Pharmacology,1993,47(4):217-222.

[15]Stoll L,Schubert T,Müller WE.Age-related deficits of central muscarinic cholinergic receptor function in the mouse:partial restoration by chronic piracetam treatment[J].Neurobiol Aging,1992,13(1):39-44.

Study on pharmacological effects and mechanism of Naozhifu as a new drug candidate for prevention and treatment of Alzheimer′s disease base on multiple targets strategy*

AiJiachen1,2,LiaoYingyang3,XiongJingyue2,XiaoYing1,2,ShiYikun1,2,TangDaxuan2,ZhangLi2,TanZhenghuai2△

(1.ColledgeofPharmacyChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610072,China; 2.InsituteofPhamacologyToricdogy,SichuanAcademyofChineseMedicineScience,Chengdu,Sichuan610041,China； 3.ZhongqiPharmaceuticalTechnology(Shijiazhuang)Co.,Ltd.,CSPCPharmaGroup,Shijiazhuang,Hebei050035,China)

Objective To evaluate the effect of Naozhifu as a multifunctional agents for the prevention and treatment of Alzheimer’s disease(AD).Methods On 30th after castration,female mice were received intrahippocampal injection of Aβ1-42and ibotenic acid for replicating the AD model.On the next day,these modeled mice were randomly divided into model group，low dose of Naazhifu group，middle dose of Naozhifu group，high dose of Naozhifu group and piracetam group,sham operated mice were set as control group.Then the gavage was given once a day for 4 consecutive weeks.Furthermore the step-down passive avoidance test,morris water maze test and biochemical indicators detection were performed.Results In step-down passive avoidance test,the latent period in model group was significantly shortened(P<0.05),the fault frequency was increased when compared with control group(P<0.05).During the Morris Water Maze test,the latent period for seeking escape from platform in AD mice were obviously extended(P<0.05),the times of passing through the platform was shortened(P<0.05),the swimming path length around the escape from platform,swimming time and distance in the effective area in AD mice were increased(P<0.05),meanwhile the level of MDA in brain tissue was significantly increased,while the levels of Ach and SOD were significantly decreased(P<0.05).These indicators in middle and high dose of Naofuzhi group obviously improved.Conclusion Naofuzhi has the multi-target prevention and treatment effect on AD.

Alzheimer′s disease;Naozhifu;Aβ1-42;ibotenic acid

四川省科技厅资助项目(A-2014N-6)。

艾佳晨(1991-)，在读硕士，主要从事老年痴呆研究。
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，E-mail:tanzhh616@163.com。

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.005

R285

A

1671-8348(2016)10-1313-03

2015-12-18

2016-01-16)