神经元特异性烯醇化酶和U266细胞株对破骨样细胞作用的研究*

袁忠涛，卿 晨，李晓进，张学美，史明霞，黄 颖，李惠民△

(1．昆明医科大学第一附属医院血液科 650032；2.昆明医科大学药学院暨重点实验室 650500； 3.昆明医科大学第四附属医院血液科 650021)

神经元特异性烯醇化酶和U266细胞株对破骨样细胞作用的研究*

袁忠涛1，卿 晨2，李晓进3，张学美1，史明霞1，黄 颖1，李惠民1△

(1．昆明医科大学第一附属医院血液科 650032；2.昆明医科大学药学院暨重点实验室 650500； 3.昆明医科大学第四附属医院血液科 650021)

目的 探讨神经元特异性烯醇化酶(NSE)和人多发性骨髓瘤细胞U266对人破骨样细胞(OLC)功能的影响。方法 采用正常人外周血单个核细胞加用细胞核因子κB受体激治蛋白配体(RANKL)+巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的方法诱导培养OLC；实验分3组，NSE组：将6孔培养板中培养14 d的OLC，分别加入100 ng/mL重组人NSE培养24、48、72 h；共培养组：将6孔Transwell小室下室中培养14 d的OLC，各上室分别加入1×105/孔U266细胞进行共培养24、48、72 h；对照组：单独培养的OLC。通过实时荧光定量PCR比较 NSE和U266细胞株对OLC的RANKL、扩胃蛋白(OPG)、IL-6和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) mRNA转录水平的影响。结果 共培养组、NSE组和对照组RANKL、OPG、IL-6 mRNA在OLC均不表达；与对照组相比，共培养组、NSE组的TRAP mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)；TRAP mRNA表达水平的升高尤其以48 h和72 h明显。结论 本试验中OLC表达TRAP，NSE是促进骨髓瘤骨病中OLC分化和成熟的因素，提示NSE能增强OLC的活性。

磷酸丙酮酸水合酶；骨髓瘤骨病；破骨细胞；酸性磷酸酶

骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)是影响多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者生存质量和预后的主要因素[1]，MBD的发生、发展是多因素作用的结果，MM细胞活化破骨细胞(osteoclast,OC)，抑制成骨细胞(osteoblast,OB)活性，导致骨代谢失衡是其主要的病理生理机制，其中OC为主要的效应细胞[2]。细胞核因子κB(NF-κB)受体激活蛋白(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)/NF-κB受体激活蛋白配体(receptor activator of nuclear factor κB lisand，RANKL)/护骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)系统是耦联OB和OC功能最重要的方式，RANKL为Ⅱ型跨膜蛋白,主要由OB和基质细胞产生，是介导OC分化和活化的关键因子[3]。RANKL在MM患者来源的浆细胞中高表达，而且有溶骨病变患者的表达水平明显高于无溶骨病变者[4]。RANK属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，可表达于OC的前体细胞和成熟的OC表面。RANKL与RANK结合后促使OC前体细胞分化成OC而产生溶骨效应，同时RANKL通过NF-κB和Jun N-终端激酶(JNK)途径，直接活化成熟的OC，促进骨的重吸收[5]。OPG是RANKL的可溶性诱导受体，可竞争性阻止RANK与RANKL结合，抑制OC的分化和活化。MM细胞除影响RANKL的表达外，还可抑制OB和基质细胞分泌OPG，从而减少骨髓微环境中的OPG。在MM患者中OPG产生明显减少，RANKL/OPG比例失调，造成骨代谢失衡，促进溶骨病变的同时也促进瘤细胞本身的增殖，最终造成OC活化与骨髓瘤进展的恶性循环[6]。MM细胞本身不表达OPG，但可通过细胞间的相互作用直接抑制骨髓基质细胞表达OPG[7]。破骨样细胞(osteoclast-like cell,OLC)功能与OC相似[8]，人外周血单个核细胞诱导培养的OLC为研究提供了细胞来源。OLC能分泌并表达特异性标志酶抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，TRAP能参与骨吸收的调节[8]。神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolas,NSE)在多种实体瘤和MM等血液肿瘤中均有表达[9-12]，且与溶骨性病变有关[13]，但NSE在MBD中如何起作用，对OC的影响如何尚不清楚。本研究旨在通过人外周血单个核细胞诱导培养OLC，并通过NSE和人多发性骨髓瘤细胞株U266对OLC的作用，观察NSE对OLC功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 外周血来源于8名健康志愿者，其中男3名，女5名，平均年龄(25.1士2.4)岁，血常规正常；人多发性骨髓瘤细胞株U266由第二军医大学上海长征医院侯健教授惠赠传代培养。主要试剂：RANKL和人巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)购自英国PeproTech公司，TRAP染色试剂盒购自南京建成生物研究所，TRIzol试剂购自美国Roche公司，逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司，RANKL、OPG、IL-6和TRAP基因扩增相关引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单个核细胞诱导培养OLC

1.2.1.1 分离人外周血单个核细胞 抽取外周血20 mL，置于含1 mL无菌肝素钠生理盐水(1 000 U/mL)的50 mL离心管中，加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，充分混匀，并分为两等份(各20 mL)；另取两支50 mL离心管，分别加入20 mL淋巴细胞分离液(Ficoll)，将装有Ficoll液的离心管倾斜45°，用尖头吸管将等体积的稀释标本沿管壁(距离液面1 cm处)缓慢加入离心管，使其轻铺在Ficoll液上，2 000 r/min离心25 min，小心吸取单个核细胞层置于新的离心管；加入5倍体积PBS重复洗涤细胞2次(1 500 r/min离心10 min)，获得单个核细胞；加入含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM培养液，将细胞吹打均匀。取部分细胞悬液，加入适量NH4Cl裂解液裂解残存的红细胞，2 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入含10% FBS的α-MEM培养液重悬细胞，吸取10 μL置于血细胞计数板上，计算细胞浓度。

1.2.1.2 细胞的纯化 将上述单个核细胞的密度重调，以1.5×106/mL种植于25 cm2培养瓶，每瓶加入含10% FBS和100 IU/mL青、链霉素的α-MEM培养液5 mL，置于在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育。24 h后轻轻倒去瓶中的上清液，用不含FBS的α-MEM培养基反复冲洗，去除未贴壁细胞。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)液，常温消化1～3 min后置于倒置显微镜下观察，待细胞变圆，立即加入含10%FBS的α-MEM培养液终止胰蛋白酶的作用。用弯头吸管轻轻吹打细胞，待细胞脱离瓶壁，吸取细胞悬液，将细胞悬液1 000 r/min离心10 min，弃上清液。

1.2.1.3 OCL的诱导培养 将上述分离的人外周血单个核细胞以1.5×106/mL种植于培养瓶，进行细胞纯化；将纯化的细胞以5×105/孔的密度接种于96孔培养板(预先将牙质片层铺入培养板中)及1×106/mL的密度接种于6孔和24孔培养板，加入含重组人RANKL 100 ng/mL、M-CSF 50 ng/mL 和10% FBS的α-MEM培养液在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内诱导培养。

1.2.1.4 细胞形态学观察 用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化和分化。

1.2.1.5 OCL的鉴定 TRAP染色：取培养14 d左右的细胞爬片，经洗涤、固定和清洗；按照TRAP染液说明书具体步骤进行染色，并用苏木素复染，清洗后自然风干；水性封片剂封片后光镜观察TRAP阳性细胞，照相。骨吸收陷窝观察：取出96孔培养板诱导培养28 d OLC作用的牙质片层，经清洗、固定、风干及乙醇梯度脱水等处理，扫描电镜观察OLC对牙质片层的骨质破坏情况。

1.2.2 实验分组 NSE组：将6孔培养板中培养14 d的OLC，分别加入100 ng/mL重组人NSE培养24、48、72 h；共培养组：将6孔Transwell小室下室中培养14 d的OLC，各上室分别加入1×105/孔U266细胞进行共培养24、48、72 h；对照组：单独培养的OLC。每孔设3个平行复孔。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测OLC的RANKL、OPG、IL-6和TRAP mRNA转录水平的表达情况 按预设时间点收集NSE组、共培养组和对照组样本,采用Trizol试剂盒，严格按照试剂操作说明提取单个核细胞的总RNA,紫外分光光度仪测定RNA 含量及纯度，反转录合成cDNA，以GAPDH作为内参照对cDNA产物行PCR扩增，各目的基因扩增引物见表1。扩增过程为95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 15 s变性，59 ℃ 20 s退火，68 ℃ 50 s延伸，40个循环结束反应。实时荧光定量PCR检测目的基因表达：反应结束后，以GAPDH为内参照，实时荧光定量PCR检测RANKL、OPG、IL-6和 TRAP基因的表达，由 ABI7300随机软件分析扩增曲线和产物熔解曲线，按照相对定量公式 2-△△Ct计算目的基因参照管家基因的相对含量，每一标本设置3个平行管，以3个平行管所得到Ct值的均值计算，比较各组RANKL、OPG、IL-6和 TRAP基因的表达情况。

表1 扩增引物序列

2 结 果

2.1 细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察诱导培养6～7 d,有个别单个核细胞体积增大，出现融合现象,形态多为圆形或椭圆形，14 d左右可观察到圆形、椭圆形、长条形、漏斗形或不规则形的多核巨细胞，见图1。

2.2 TRAP染色结果 诱导培养14 d，取出细胞爬片进行TRAP染色，可观察到圆形、椭圆形、长条形、漏斗形或不规则形的细胞，体积较大，细胞质丰富,细胞质内可见酒红色颗粒沉积，部分细胞质中可见大小不等空泡,核数个，呈淡黄色，细胞核清晰，大小不一,聚积在细胞中央或排列在细胞周边。苏木素复染后细胞核染呈蓝色，细胞质仍为酒红色，见图2。

2.3 牙质片层扫描电镜结果 诱导培养OLC 28 d，骨片表面可见形态不规则的吸收陷窝，常规培养组(未进行诱导培养)对照组骨片表面未见骨吸收陷窝，见图3。

A：3 d；B：7 d；C：12 d；D：14 d。

图1 人外周血单个核细胞经RANKL+M-CSF诱导下不同时间段的细胞形态(×200)

A：TRAP染色(×200);B：TRAP染色(×400);C：TRAP染色+苏木素复染(×200);D：TRAP染色+苏木素复染(×400)。

图2 诱导培养14 d TRAP染色的细胞形态

A：对照组(SEM×1 000);B：诱导培养组(SEM×1 000)。

图3 骨吸收陷窝扫描电镜观察

a:P<0.01,与对照组比较；b:P<0.01,与24 h比较。

图4 3组不同时间TRAP mRNA表达水平的变化趋势图

2.4 各组OLC时RANKL、OPG、IL-6和TRAP mRNA表达情况 共培养组、NSE组及对照组RANKL、OPG、IL-6 mRNA均不表达；共培养组、NSE组与对照组相比，TRAP mRNA转录水平的表达呈升高趋势，差异有统计学意义(P<0.01)。共培养组、NSE组48 h和72 h TRAP mRNA的表达水平高于24 h，差异有统计学意义(P<0.01)，两组48 h和72 h TRAP mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；对照组24、48、72 h TRAP mRNA的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2、图4。

3 讨 论

正常情况下，骨形成和骨吸收处于动态平衡状态，这是骨重塑过程。OC和OB是这一过程中的主要细胞，协调成骨与破骨的动态平衡，从而维持骨的相对稳定[14]。OC是体内生理状态下惟一有骨吸收功能的细胞，在生理性骨重建和病理性骨吸收中起重要作用[15]。OC在受到MM细胞或骨髓微环境中其他细胞的刺激下，可致细胞数量增多，功能活跃，出现溶骨增强[16]。

OC是高度分化的终末细胞，体外分离的细胞只能存活7～14 d，且获得的细胞数量有限。经诱导培养的OLC在功能上与OC相似，相对容易获得、纯度较高。本试验参照文献方法[17-19]，采用正常人外周血单个核细胞加用RANKL+M-CSF的方法诱导培养OLC，为MBD的体外研究提供可靠的细胞来源。

OC从发育、成熟、活化再到发挥骨吸收功能经历一个复杂、多级的调节过程，而OC的分化和成熟是调控整个骨吸收过程的重要靶点，RANK/RANKL/OPG系统在介导OC分化和成熟方面起到关键的作用。RANKL与OC和破骨前体细胞膜表面表达的RANK结合，能促进OC的分化、成熟，增强其活性，抑制凋亡[20]。本研究中OLC不表达RANKL，与文献报道一致[21]。成熟的OC和OLC分泌并高表达TRAP，且具有噬骨功能[8]。本试验中OLC表达TRAP，并能在牙质片层片上形成骨吸收陷窝，也验证了本研究诱导培养的细胞为OLC；而且试验结果显示共培养组和NSE组TRAP的表达上调，提示在体外MM细胞和NSE能增强OLC的活性。

烯醇化酶是参与糖酵解途径中2-磷酸甘油酸转化成磷酸烯醇式丙酮酸的限速酶，它由α、β、γ亚基以二聚体形式组成免疫性质不同的αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5种同工酶；其中γγ、αγ主要存在于神经元和神经内分泌细胞中，称为NSE[22]。另有实验证实正常的T和B淋巴细胞在特定发展阶段也表达NSE[23]，这说明NSE不是神经内分泌细胞所特有的。Li等[24]研究发现在体外NSE能促进人视网膜母细胞瘤细胞的增殖，并认为NSE是一种神经细胞生存和营养因子。MM细胞株U266表达NSE，MM患者血清中也发现NSE水平明显升高，且与临床分期、骨损害程度及治疗效果存在相关性。应用NSE处理OLC，TRAP mRNA转录水平的表达上调，提示NSE促进OLC的分化和增殖；NSE具有U266细胞对OLC的类似作用；推测NSE可能通过细胞代谢或作为营养因子起作用，但是否有其他某种方式的参与尚不清楚，目前国内外亦无这方面研究的报道，值得进一步探讨。

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Study on effect of NSE and U266 cell line on osteoclast-like cells*

YuanZhongtao1,QingChen2,LiXiaojin3,ZhangXuemei1,ShiMingxia1,HuangYing1,LiHuimin1△

(1.DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China; 2.CollegeofPharmacy,KeyLaboratory,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China; 3.DepartmentofHematology,FourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China)

Objective To explore the functions of neuron-specific enolase(NSE) and human multiple myeloma U266 cells on osteoclast-like cells(OLC) function.Methods Normal human peripheral blood mononuclear cells were induced and cultured by adding RANKL and M-CSF to get OLC;the experiment was divided into 3 groups,the NSE group:OLC were cultured in the 6-well culture plate for 14 d and added with 100 ng/mL recombinant human NSE to culture for 24,48,72 h;the co-culture group:OLC were cultured in the lower well of 6-well Transwell chamber for 14 d,then added with 1×105/well U266 cells in each upper well and conducted the co-culture for 24,48,72 h;the control group:OLC were cultured alone.The influences of NSE and U266 cell line on RANKL,OPG,IL-6 and TRAP mRNA transcriptional level of OLS were compared by using real-time fluorescent quantitative PCR.Results RANKL,OPG,IL-6 mRNA had no expression on OLC in the co-culture group,NSE group and control group;compared with control group，the TRAP mRNA expression level in the co-culture group and the NSE group was increased,the difference was statistically significant(P<0.01);the increase of TRAP mRNA expression level was obvious especially at 48,72 h.Conclusion OLC expressing TRAP and NSE may be one of the factors for promoting OLC differentiation and maturation in myeloma bone disease,prompting that NSE could increase the OLC viability.

phosphopyruvate hydratase;myeloma bone disease;osteoclast;acid phosphatase

云南省应用基础研究面上项目(2007C0037R)。

袁忠涛(1974-)，主治医师，硕士，主要从事血液肿瘤研究。
△

，E-mail:lihuimin@medmail.com.cn。

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.004

R783.5

A

1671-8348(2016)10-1309-04

2015-12-15

2016-01-22)