miRNA-152表达与NSCLC对顺铂耐药的关系及其机制研究

郭 迪，李宏云△，杨 华

(郑州大学第五附属医院:1.呼吸内科;2.普通外科，郑州 450052)

miRNA-152表达与NSCLC对顺铂耐药的关系及其机制研究

郭 迪1，李宏云1△，杨 华2

(郑州大学第五附属医院:1.呼吸内科;2.普通外科，郑州 450052)

目的 研究微小RNA-152(miRNA-152)在非小细胞肺癌(NSCLC)顺铂(DDP)耐药过程中的作用机制。方法 实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测NSCLC细胞株A549及其DDP耐药株A549/DDP细胞内的miRNA-152水平。通过转染miRNA-52模拟物(miRNA-152 mimic)以提高A549/DDP细胞内的microRNA-152水平。MTT试验、倒置相差显微镜技仪和流式细胞术观察上调miRNA-152对细胞增殖及凋亡的影响，同时采用qRT-PCR和Western blot技术观察细胞内Bcl-2及核转录因子-κB(NF-κB)水平变化。结果 A549/DDP细胞中存在miRNA-152的低表达，Bcl-2及NF-κB的高表达。上调miRNA-152后，DDP造成的A549/DDP细胞增殖抑制率和凋亡率显著高于未上调miRNA-152的细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，miRNA-152 mimic转染可显著降低A549/DDP细胞中的Bcl-2及NF-κB表达。结论 低miRNA-152表达可能引起NSCLC对DDP的耐药，miRNA-152可能通过调节Bcl-2及NF-κB的水平介导NSCLC细胞对顺铂的敏感性。

癌,非小细胞肺；微小RNAs；Bcl-2；核因子κB；顺铂；药物耐受性

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的生长分裂较慢，扩散转移较晚，因此大部分患者在首诊时已经进入进展期，丧失了手术根治的时机。这种情况下，NSCLC的非手术治疗就成为了治疗的重要环节[1]。非手术治疗主要包括靶向治疗和化学治疗，对于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变阳性的NSCLC患者来说，首选方案为EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)靶向治疗，如使用吉非替尼等药物。而对于EGFR突变阴性的NSCLC患者EGFR-TKI的使用效果有限，因此这类患者首选化学治疗[2-3]。化学治疗方案中，以铂类药物为基础的联合化学治疗应用广泛，如顺铂(cisplatin，DDP)方案的效果已经得到临床证实。但是NSCLC患者对铂类药物的耐药现象同样不容忽视，进一步探索NSCLC患者对铂类药物耐药的机制具有重要意义[4]。近年来微小RNA(microRNA,miRNA)的转录后调控作用备受瞩目，大量研究发现miRNA的表达变化与肿瘤的发生、发展及耐药机制有关。研究证实NSCLC患者存在miRNA-152的低表达[5]，但关于miRNA-152表达与NSCLC对铂类药物耐药之间的关系还鲜有研究。因此，本研究探讨耐药的A549细胞中miRNA-152表达变化，观察其对DDP敏感性的影响，并初步阐述其介导耐药的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料 人肺腺癌A549细胞株购自上海中科院细胞库，DDP耐药A549/DDP细胞株购自上海斯信生物科技有限公司。胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司。miRNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。ImProm-ⅡTM逆转录试剂盒、GO Taq®qPCR Master Mix试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。Trizol试剂及LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。CCK-8试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司。ECL发光试剂盒购自北京普利来生物科技有限公司。鼠抗人Bcl-2抗体、鼠抗人NF-κB抗体、鼠抗人GAPDH抗体、二抗购自英国Abcam公司。miRNA-152模拟物购自上海吉玛公司。

1.2 细胞培养 A549细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基。A549/DDP细胞株培养于含12%胎牛血清的DMEM培养基，正常传代3次后，须向培养基加入DDP，并维持DDP水平为2 μg/mL以保持其耐药性。培养环境均为5% CO2，37 ℃。A549/DDP细胞的耐药性已经在预试验中得到验证，耐药指数约为4.51。

1.3 实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测miRNA-152 使用miRNA 快速提取试剂盒提取并纯化A549细胞及A549/DPP细胞中的miRNA。使用ImProm-ⅡTM逆转试剂盒将提取的miRNA转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系和条件严格参照厂商提供的说明书。miR-152正向引物序列为5′-GAG TGC TCA GTG CAT GAC AG-3′，反向引物序列为5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。采用U6 RNA作为内参，其正向引物序列为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，反向引物序列为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。以2-ΔΔCt法计算miRNA-152的相对表达情况。其中ΔCt=Ct目标-Ct内参。

1.4 qRT-PCR检测Bcl-2 mRNA和NF-κB mRNA 使用Trizol试剂提取A549细胞及A549/DPP细胞中的总RNA。ImProm-ⅡTM逆转录试剂盒对提取出的总RNA进行逆转录，以合成cDNA。逆转录体系参照试剂盒提供的说明书。使用GO Taq®qPCR Master Mix试剂盒对上述合成的cDNA进行PCR扩增。Bcl-2的正向引物为5′-TTC TTT GAG TTC GGT GGG GTC-3′，反向引物为5′-TGC ATA TTT GTT TGG GGC AGG-3′；NF-κB的正向引物为5′-CTG CAT TTC CAC AGT TTC CAG AACC-3′，反向引物为5′-ACG CTG CTC TTC TAT AGG AAC TTG G-3′；内参GAPDH的正向引物为5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，反向引物为5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。反应体系和方案参照试剂盒说明书。使用2-△△CT法分析目的mRNA的相对表达情况。

1.5 Western blot法检测Bcl-2和NF-κB 提取A549细胞及A549/DPP细胞中的总蛋白，使用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，并转膜。转膜结束后，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别使用1∶1 500的鼠抗人Bcl-2抗体，1∶2 000的鼠抗人NF-κB抗体及鼠抗人GAPDH抗体，4 ℃孵育12 h。接着使用磷酸盐缓冲液-Tween 20(PBST)洗涤3次，除去未结合的一抗。二抗稀释后(1∶1 000)与膜接触，室温下孵育1～2 h，ECL发光试剂盒显色并分析条带。

1.6 miRNA-152的过表达 转染前将A549/DDP细胞转移至不含DDP的培养基中常规培养，待细胞贴壁后，消化细胞制备细胞悬液，以6 000/孔的细胞密度将细胞接种于96孔板，当细胞汇合度达到80%左右时，使用LipofectamineTM2000转染试剂盒将miRNA-152模拟物(miRNA-152 mimic)转入细胞，miRNA-152 mimic的工作水平为50 nmol/L，相同方法转染无关miRNA mimic作为阴性对照。继续培养48 h，qRT-PCR验证转染效果。

1.7 CCK-8试验及形态学检查分析miRNA-152上调对细胞抑制率的影响 将A549/DDP细胞分为5组：未经DDP处理且未任何转染处理的A549/DDP细胞(A组)，未经DDP处理，但经无关miRNA mimic转染处理的A549/DDP细胞(B组)，未经DDP处理，但经miRNA-152 mimic转染处理的A549/DDP细胞(C组)，经3 μmol/L DDP处理，但未经任何转染处理的A549/DDP细胞(D组)，经3 μmol/L DDP处理且经无关miRNA mimic转染处理的A549/DDP细胞(E组)，经3 μmol/L DDP处理且经miRNA-152 mimic转染处理的A549/DDP细胞(F组)。处理24 h后，MTT法计算各组抑制率。倒置相差显微镜观察各组细胞的增殖情况。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡率 细胞分组同上，各组处理时间达到后，常规收集细胞，使用Annexin V-FITC试剂盒内的缓冲液重新悬浮细胞。依此加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混匀后室温避光孵育15 min上机检测。

1.9 qRT-PCR及Western blot分析miRNA-152过表达对细胞Bcl-2及NF-κB表达的影响 培养未经转染的A549/DDP细胞(空白对照组)，转染miRNA-152 mimic 的A549/DDP细胞(试验组)，以及转染无关miRNA mimic的A549/DDP细胞(阴性对照组)48 h。按上文所述方法提取3种细胞中的总RNA及总蛋白样本。qRT-PCR及Western blot分析方法同上，相关引物和抗体均同前，检测miRNA-152上调后A549/DDP细胞中Bcl-2及NF-κB的表达变化。

2 结 果

2.1 A549/DDP细胞的miRNA-152表达 与A549细胞相比，A549/DDP细胞miRNA-152表达较低，相对降低的倍数为(0.65±0.04)倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 A549及A549/DDP细胞中的miRNA-152相对表达水平

2.2 A549/DDP细胞的Bcl-2及NF-κB表达 与A549细胞相比，A549/DDP细胞Bcl-2及NF-κB mRNA 表达水平较高，分别相对提高了(1.53±0.21)倍和(1.37±0.13)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot分析证实，Bcl-2及NF-κB蛋白表达同样在A549/DDP细胞中较高，见图2、3。

A：Bcl-2；B:NF-κB。

图2 A549及A549/DDP细胞中的Bcl-2、NF-κB mRNA相对表达水平

图3 A549及A549/DDP细胞中的Bcl-2及NF-κB蛋白表达水平

2.3 miRNA-152表达上调增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性 如图4所示，B、C、D、E、F组的细胞增殖抑制率分别为(7.5±2.5)、(6.8±2.1)、(22.6±3.8)、(23.4±3.4)、(41.3±4.4)%。其中F组细胞抑制率显著高于D组和E组，差异有统计学意义(P<0.05)。形态学结果显示，DDP能够抑制细胞增殖且F组细胞增殖显著低于D组，见图5。

图4 3 μmol/L DDP处理 A549/DDP细胞24 h后的细胞抑制率

图5 各组细胞倒置相差显微镜图像(×200)

A:流式细胞分析图；B：凋亡分析图。

图6 3 μmol/L DDP处理 A549/DDP细胞24 h后的流式细胞分析图和凋亡分析图

2.4 miRNA-152表达上调增加DDP引起的A549/DDP细胞凋亡 如图6所示，A、B、C、D、E、F组的细胞凋亡率分别为(3.8±1.3)、(4.4±0.9)、(4.8±1.1)、(14.5±2.2)、(13.2±1.9)、(22.3±2.1)%。其中F组细胞凋亡率显著高于D组和E组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 miRNA-152表达上调可以降低A549/DDP细胞中Bcl-2及NF-κB的表达 qRT-PCR发现，试验组Bcl-2及NF-κB mRNA 水平较空白对照组及阴性对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示，试验组Bcl-2及NF-κB 蛋白水平也显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。图7、8。

A：Bcl-2;B：NF-κB。

图7 miRNA-152 mimic 转染对A549/DDP细胞中Bcl-2、NF-κB mRNA水平的影响

图8 miRNA-152 mimic 转染对A549/DDP细胞中Bcl-2和NF-κB mRNA水平的影响

3 讨 论

DDP的耐药机制较为复杂，主要涉及药物转运、药物解毒、细胞凋亡等多个方面，常见的机制有如下几个方面：(1)细胞膜上的分子泵表达异常，大量药物排出细胞外，导致细胞内的药物水平降低，如人类多药耐药基因编码的P-gp过表达引起的耐药，P-gp由人类多药耐药基因(mul-tidrug resistance gene，MDR)家族中的mdr1编码产生，定位于细胞膜，是一种能量依赖性的分子泵，它能将DDP或其他化学治疗药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞内的药物水平降低或者药物重分布[6]。(2)细胞的药物解毒效应增强，也导致药物代谢、排除增加或者药物毒性减少，如谷胱甘肽转硫酶π家族的表达异常引起的耐药，谷胱甘肽转硫酶π可增加药物极性、清除药物的代谢产物、阻止药物与肿瘤细胞的DNA结合及催化谷胱甘肽与亲电子物质结合、消除化学治疗药物产生的活性氧损伤，避免细胞膜上的脂质氧化[7]。(3)DNA的修复功能异常，如拓扑异构酶Ⅱ的突变会造成DDP耐药。(4)凋亡调控蛋白的异常，DDP可能通过一些凋亡调控因子促进细胞凋亡，这些调控因子异常时，可能造成DDP的疗效降低[8]。

很多关于肿瘤的研究开始关注miRNA与肿瘤发生发展及耐药现象的关系。miRNA是一类长约21～25 nt的非编码小分子RNA，其在转录后水平上抑制靶基因的表达，从而调控细胞的增殖、凋亡等生命现象。越来越多的研究证实，miRNA与肿瘤关系密切，影响肿瘤的进展、分化、转移甚至耐药等[9]。特别是耐药是临床上肿瘤内科治疗亟待解决的瓶颈问题，寻找可以用于逆转耐药的潜在的miRNA靶点引起人们广泛的兴趣。有研究表明，乳腺癌的阿霉素耐药株MCF-7/ADR与非耐药株相比，存在36个miRNA的表达差异[10]。还有研究发现，miR-17～92基因簇与卵巢浆液性癌化学治疗耐药有关，可用于化学治疗效果的评估[11]。本研究发现与非耐药的A549细胞相比，对DDP耐药的A549/DDP细胞存在miR-152的低表达，因此，作者认为较低的miR-152表达抑制肿瘤细胞的凋亡，不利于治疗。此观点与既往的一些研究结果类似，如有研究发现miRNA-152可以抑制NSCLC的生长和侵袭能力，过低的miRNA-152表达增加了肿瘤细胞增殖[5]。

当然，miRNA在肿瘤的耐药中要发挥作用，必然通过其靶基因，具体机制涉及：(1)miRNA可以调节一系列耐药相关蛋白。如miR-298可以抑制MDR-1的表达，进而减少P-糖蛋白的表达，起到缓解乳腺癌细胞耐药的作用。相反，miR-27a激活MDR-1，引起肿瘤细胞耐药[12]；(2)miRNA可以影响药物的靶点蛋白，从而引起耐药性的改变。如在小细胞肺癌中，miR-126可以血管内皮生长因子为靶基因，减少其表达，后者为贝伐单抗的靶点，因此miR-126可以增加miRNA对贝伐单抗的敏感性[13]；(3)miRNA可以影响药物的转运。研究发现miR-206可以靶向抑制连接蛋白，后者发挥转运药物的功能，其功能受限后，会导致药物不能向邻近细胞转运；(4)miRNA可以影响药物引起的细胞死亡。如miR-21可以下调Bax的水平，从而抑制凋亡发生[9]。

虽然很多研究发现miR-152在肿瘤中存在低表达，且具有抑制肿瘤的功能[14-15]，但未见有研究报道miR-152与化学治疗耐药的关系。本研究中，使用miR-152 minic上调A549/DDP细胞的miR-152后，发现原本耐药的细胞对DDP的敏感性提高了。同时发现miR-152 mimic降低耐药细胞中Bcl-2和NF-κB的表达水平。因此，作者认为miR-152可能通过调节Bcl-2和NF-κB发挥药物敏感性的调节作用。Bcl-2和NF-κB均为公认的抗凋亡基因。大量研究证实，肺癌、胃癌、卵巢癌，以及结肠癌等均存在Bcl-2和NF-κB过表达，二者的抗凋亡作用在肿瘤细胞的恶性增殖过程中扮演重要角色，与侵袭和转移行为密切相关[16-17]。在耐药性研究方面，Hall等[18]发现Bcl-2可以作为生殖系统肿瘤化学治疗的靶点，较高的Bcl-2意味着较差的预后。Sun等[19]发现肺腺癌A549细胞中的NF-κB表达过高，抑制NF-κB的表达可以增加A549对化学治疗药物的敏感性。本研究中miR-152表达上调后，Bcl-2和NF-κB表达减少，抗凋亡减弱，这可以解释为何原本耐药的A549/DDP细胞对DDP的敏感性得到了提高。但Bcl-2和NF-κB是否是miR-152的直接靶基因，还是miR-152调节通路下游的某个环节，需要进一步的研究证实。

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Relation between microRNA-152 expression and cisplatin resistance in non-small cell lung cancer cells and its mechanism

GuoDi1,LiHongyun1△,YangHua2

(1.DepartmentofRespiration;2.DepartmentofGeneralSurgery,FifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China)

Objective To investigate the action mechanism of microRNA-152(miRNA-152) in the cisplatin(DDP) resistance process in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods The miRNA-152 level in NSCLC cell line A549 and its cisplatin-resistant cell line A549/DDP was detected by the real time quantitative PCR(qRT-PCR).miRNA-152 mimic was transfected for increasing the intracellular miRNA-152 level in A549/DDP.The MTT assay,inverted miroscope technique and flow cytometry were adopted to observe the effect of up-regulating miRNA-152 on cell proliferation inhibition and apoptosis,meanwhile,the level changes of intracellular Bcl-2 and NF-κB were also observed by adopting qRT-PCR and Western blot.Results The low expression of miRNA-152 and the high expression of Bcl-2 and NF-κB were found in A549/DDP cells.Up-regulation of miRNA-152 enhanced the inhibitory effect of DDP in A549/DDP cells.Furthermore,after up-regulating miRNA-152,the inhibiting rate and apoptosis rate of A549/DDP cells caused by DDP were significantly higher than those in the cells without up-regulating miRNA-152,the difference was statistically significant(P<0.05).In addition,miRNA-152 mimic transfection significantly decreased the expression of Bcl-2 and NF-κB in A549/DDP cells.Conclusion Low expression of miRNA-152 may induce the resistance of NSCLC to DDP,miRNA-152 could mediate the sensitivity of NSCLC cells to DDP via regulating Bcl-2 and NF-κB levels.

carcinoma,non-small-cell lung;microRNAs；Bcl-2；NF-κB;cisplatin;drug tolerance

郭迪(1980-)，主治医师，硕士，主要从事呼吸内科研究。△

，E-mail:drliofres@163.com。

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.001

R734.2

A

1671-8348(2016)10-1297-05

2015-11-08

2015-12-20)