长沙一例猪疹块型红斑丹毒丝菌的分离与鉴定

唐爱明，陈 智，郑姣妹，刘增再，宁华杰

（湖南省长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙410013）

长沙一例猪疹块型红斑丹毒丝菌的分离与鉴定

唐爱明，陈 智，郑姣妹，刘增再，宁华杰

（湖南省长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙410013）

根据农业部NY/T566-2002猪丹毒诊断技术检验标准，通过全自动微生物鉴定系统，对送检的猪肉病料进行猪红斑丹毒丝菌检验，并对检验过程和结果进行分析，为动物源性食品中红斑丹毒丝菌等致病菌的检验提供依据，确保动物源性食品安全，为长沙市建设国家食品安全城市提供技术支撑。

猪肉病料；红斑丹毒丝菌；分离鉴定；食品安全

猪丹毒是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性败血症和亚急性疹块型疾病，俗称“打火印”或“鬼打印”[1]，为我国“三大猪传染病之一”。猪丹毒死亡率可达80％～90％,主要侵害架子猪，广泛流行于世界各地，对养猪业危害很大。我中心近期在长沙市某屠宰检疫中，发现皮肤上出现紫红色疹块猪病病例。按照农业部《NY/T566-2002猪丹毒诊断技术》检验标准[2]，对疑似猪丹毒病料进行检验，分离获得革兰氏阳性菌，生化鉴定结果显示为红斑丹毒丝菌。该菌是污染畜肉、禽肉等动物源性食品的病原菌，在兽医公共卫生学中具有重要意义。为确保肉品安全，建设长沙市国家食品安全城市构筑有效屏障，现将猪肉中红斑丹毒丝菌的分离、鉴定情况报告如下。

1试验材料

1.1被检材料

长沙地区某定点屠宰场发生有皮肤菱形疹块、疑似猪丹毒的病例，病猪体温升高41℃～42℃，精神不振，不愿走动，猪胸、腹、背、四肢的皮肤上发生疹块，呈方形或菱形，稍凸起于皮肤表面[3]。采集菱形疹块猪肉、肝脏、肺脏、淋巴等组织病料进行检验；心脏制备抹片，染色镜检，为革兰氏阳性细小杆菌，[4]见图1。

1.2培养基

马丁琼脂、马丁肉汤试剂均购自北京陆桥微生物制剂有限公司。普通绵羊血平板、巧克力平板、营养琼脂平板（NA）均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3细菌鉴定卡

GP革兰氏阳性细菌鉴定卡，法国梅里埃公司出品，批号：242372110，有效期限：20170220；AST-GP69革兰氏阳性细菌药敏卡，生产批号：134351420，有限期限：20160728。

1.4细菌鉴定仪

全自动微生物鉴定/药敏分析系统（法国梅里埃公司出品，型号：VITEK2 COMPACT15）。质控菌株：金黄色葡萄球菌，菌株编号为CICC21600；大肠埃希氏菌，菌株编号为CICC10389，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。定期做质量控制，质控结果完全符合。

2病原的分离

2.1细菌的分离培养

采集发病猪皮肤疹块、肝脏、心脏病料，无菌接种于普通绵羊血平板、巧克力平板，37℃培养18～24h。对分离细菌进行纯化，染色镜检[5]。根据镜检初步结果，选取疑似菌株进行营养琼脂和马丁肉汤液体培养基培养，分别命名为PF-1、GZ-2、XZ-3，分离部位分别为皮肤、肝脏、心脏，37℃培养18～24h。

2.2菌落的形态及染色

三株分离菌PF-1、GZ-2、XZ-3培养特性、菌体形态、染色特性基本一致。在普通绵羊血平板上生长缓慢，菌落较小，表面圆整光滑湿润，边缘整齐，呈微蓝灰色露珠状，呈α-溶血，菌落周围形成草绿色的溶血环。普通绵羊血平板和马丁肉汤培养的细菌，染色镜检，显示菌体革兰氏染色为阳性。固体培养基菌体呈球状、短杆状，单个或双菌存在，见图2；液体培养基菌丝成丝状，见图3。

（革兰氏染色，1000×）图1 心脏触片高倍镜检

（革兰氏染色，1000×）图2 血琼脂培养菌体形态

（革兰氏染色，1000×）图3 肉汤培养菌体形态

2.3细菌的纯化及初步鉴别

取血琼脂平板溶血菌分别接种于胰酪胨大豆肉汤液体培养基、营养琼脂平板（NA），37℃培养24h。肉汤培养管均匀混浊,管底有灰白色长丝状菌体；普通营养琼脂上的菌落,无色透明,表面光滑,圆形较为扁平、粘稠；取NA平板新鲜菌做三糖铁琼脂（TSI）、接触酶试验、葡萄糖产气、V-P试验，观察结果见表1[6]。

表1 丹毒丝菌属生化反应初步鉴别表

3细菌的鉴定

3.1鉴定卡选择

根据菌种革兰氏染色结果，选取GP革兰氏阳性菌鉴定卡和AST-GP69革兰氏阳性细菌药敏卡进行检验。

3.2菌悬液配制及稀释

取TSA琼脂平板37℃培养18～24h新鲜菌于0.45％氯化钠悬浮液并混匀，校正比浊仪，保证测定数值在规定范围内。测定菌液浓度，菌悬液浓度为0.5～0.63麦氏单位，按操作说明进行稀释，配制相应浓度药敏卡菌悬液。

3.3生化和药敏鉴定

将三株分离菌PF-1、GZ-2、XZ-3编号，按顺序放在载卡架上，药敏卡放在配对鉴定卡后面。按细菌鉴定仪操作要求，取37℃营养琼脂培养18～24h的新鲜菌，上全自动微生物鉴定/药敏分析系统进行鉴定[7-8]。

3.3.1生化鉴定结果：鉴定卡按正常程序放入VITEK 2 COMPACT孵育箱后，仪器经过4～8h的孵育和判读，由工作电脑给出相应鉴定结果。PF-1、GZ-2、XZ-3为红斑丹毒丝菌，可能性（Probability）99％，置信度（Confidence）极度一致（Excellent identification），为相当好的鉴定。生化鉴定结果见表2。

表2 三株细菌生化鉴定结果

3.3.2药敏鉴定结果：

AST-GP69革兰氏阳性细菌药敏卡鉴定结果显示，三株细菌的药敏特性基本相同：对青霉素类药物（氨苄青霉素、青霉素G、苯唑青霉素）、氯霉素类药物（氯霉素）、喹诺酮类药物（恩诺沙星、麻保沙星）、大环内酯类药物（红霉素）、林可霉素类药物（克林霉素、卡拉霉素）、抗分枝杆菌药物（利福平）敏感；对氨基糖苷类药物（庆大霉素、卡那霉素）、多肽类药物（万古霉素）、硝基呋喃类药物（呋喃妥因）、磺胺类药物（复方磺胺甲恶唑）、四环素类（四环素）耐药。药敏结果见表3。

表3 三株细菌药敏鉴定结果

3.4血清学鉴定

取马丁肉汤培养菌，按照标准制备被检抗原，做琼脂扩散试验，同时做阳性对照、被检抗原及PBS。37℃湿盒培养24h判定结果，出现沉淀线为阳性，无沉淀线为阴性，所做结果完全符合。

4讨论与结论

4.1猪丹毒病料

急性病例可采集被检猪的心血、肝、脾、淋巴结等脏器，亚急性疹块病例可采集皮肤疹块病料；慢性病例可采集关节液和心内膜的增生物。根据临床症状作出鉴别诊断，采集有大量致病菌存在，有特异性病理变化的器官，为兽医卫生检验人员诊断疾病提供依据，以便确切诊断。

4.2病原鉴定

细菌PF-1、GZ-2、XZ-3株，综合临床症状观察、细菌分离培养、典型菌体形态特征、生化和药敏试验结果、血清学试验，鉴定其为猪红斑丹毒丝菌。由于3株细菌是同一发病猪群的不同病例，其生化和药敏特性基本相同。

4.3药敏试验

猪红斑丹毒丝菌PF-1、GZ-2、XZ-3对青霉素类药物、氯霉素类药物、喹诺酮类药物、大环内酯类药物、林可霉素类药物、抗分枝杆菌药物等均敏感；对氨基糖苷类药物、多肽类药物、硝基呋喃类药物、磺胺类药物、四环素类耐药[9]。临床防治猪丹毒时，可科学合理进行用药。

4.4猪丹毒诊断

临床症状观察和病原分离鉴定是结果判定的主要依据。日常检验工作中，我们应尽可能多做扩大生化试验来判定结果更为准确。依据典型生化反应对猪红斑丹毒丝菌进行初步判定。为避免出现漏检、假阴性、假阳性结果，应尽可能多用选择性培养基，确保检验结果的准确性[10]。

4.5猪丹毒的防治

主要是做好免疫注射；疫区进行合理用药，青霉素对本病有明显疗效，也有一定诊断意义；在非疫区搞好猪场卫生、消毒等工作，可免受猪丹毒丝菌的感染。□

[1]白文彬，于康震.动物传染病诊断学[M].北京:中国农业出版社,2002.

[2]中华人民共和国农业行业标准.猪丹毒诊断技术NY/T 566-2002. [S].北京：中华人民共和国农业部，2002.

[3]刘大贵，罗先惠.猪丹毒的屠宰检验[J]．中国动物检疫，2003，20(3)：28.

[4]孙锡斌.动物检疫检验彩色图谱[M].北京:中国农业出版社,2004.

[5]何世成，谈志祥，刘道新，等.3株猪红斑丹毒丝菌湖南株的分离与鉴定[J]．中国畜牧兽医，2011，38(5)：155-157.

[6]东秀珠、蔡妙英，等编著.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001.

[7]许伟琦主编.畜禽检疫检验手册[M].上海：上海科学技术出版社,2001.

[8]郭良兴,陈克研,赵魁,等.猪丹毒杆菌的分离鉴定及耐药性试验[J]．中国畜牧兽医,2011,38(4):199-202.

[9]中国兽医药品监察所译编.欧盟动物源性食品安全管理法规[M].北京：中国农业科学技术出版社,2003.

[10]童伟主编.食品检验、动植物检疫技术分析与管理实用大全[M].北京：中国环境科学出版社,1999.

S858.28；S854.43

A

1006-4907（2016）06-0024-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.06.010

2016-10-13

唐爱明（1974～），女，湖南长沙人，硕士，高级兽医师，主要从事动物疫病诊断和研究工作，E-mail：3316261157@qq.com。