猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

原 霖，韩 焘，倪建强，亢文华，汪葆玥，李晓霞，陈亚娜，翟新验，沈建忠

（1.中国农业大学动物医学院，北京100193；2.中国动物疫病预防控制中心，OIE猪繁殖与呼吸综合征参考实验室，北京102618）

猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

原 霖1，2，韩 焘2，倪建强2，亢文华2，汪葆玥2，李晓霞2，陈亚娜2，翟新验2，沈建忠1＊

（1.中国农业大学动物医学院，北京100193；2.中国动物疫病预防控制中心，OIE猪繁殖与呼吸综合征参考实验室，北京102618）

摘 要：轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原，轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物，将其接种MA104细胞，分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT－PCR和免疫荧光等方法鉴定，并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明，分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法，确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P［13］型、I5型和G11型。因此，将该分离株命名为Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］。

关键词：猪轮状病毒；分离；鉴定

轮状病毒（rotavirus，RV）为双股RNA病毒，由11个双链RNA组成，是引起多种新生动物和幼龄动物腹泻的重要肠道病原，也是引起哺乳和断奶仔猪胃肠炎的常见病因［1］。轮状病毒最先发现于犊牛［2］，之后在人［3］、猪［4］和其他动物［5－6］中也检测到。猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）分为A、B、C、E 4种血清群，其中A群轮状病毒最为常见且与人和猪的腹泻相关［7－8］。许多研究均已表明轮状病毒在不同物种之间可进行种间传播和基因重排。Martella等［9］报道在猪群中分离到牛轮状病毒。Varghese等［10］发现印度暴发的猪轮状病毒腹泻由人轮状病毒RNC321株引起。更多的研究［10－11］表明猪轮状病毒和人轮状病毒毒株之间存在基因重排，且基因重排的轮状病毒可引起人的腹泻［12］。因此猪轮状病毒的研究具有重要的公共卫生方面的意义。

根据2013年世界Rotavirus Classification Working Group第6次会议确定的最新分类方法，以及外衣壳蛋白VP4、VP7和VP6基因序列，A群轮状病毒存在27个G基因型、37个P基因型和18个I基因型。国内学者报道分离到猪轮状病毒［13－20］。本研究从腹泻仔猪粪便中分离得到一株猪轮状病毒，并确定为猪A型轮状病毒G11P［13］型，为后续的防控技术和致病机理方面的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病料 病料来自北京房山某猪场出现腹泻症状仔猪的肠内容物。

1.1.2细胞 MA104细胞由农业部兽医诊断中心保存。

1.1.3试剂 DMEM培养基、胎牛血清、胰酶均购自Gibco公司；Anigen Rapid Rota Ag Test Kit购自安捷公司；抗A型轮状病毒单克隆抗体购自Ingenasa公司；FITC标记的兔抗鼠抗体购自Sigma公司。RNeasy?Mini Kit购自Qiagen公司；pEASY－T3Cloning Kit试剂盒、Trans－T1感受态细胞均购自北京全式金公司；猪轮状病毒实时荧光RT－PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨有限公司。

1.2方法

1.2.1病料处理 取小肠和粪便用1%PS DMEM洗2遍，然后剪碎研磨成糊状，加入无血清DMEM细胞培养液，制成10%组织悬液，4℃、10 000r／min离心15min，吸取上清液，用0.2μm微孔针头滤器过滤。于－80℃备用。

1.2.2病毒接种 在病毒液中加入终浓度为10μg／mL的胰酶，37℃水浴30min。待MA104细胞生长至90%以上单层时（传代12～24h）弃去培养液，用无血清的DMEM洗2遍。按培养液量的10%接种样品。置于37℃、5%CO2培养箱孵育1h。弃去病毒液，补加无血清的DMEM。置于37℃、5%CO2培养箱静置培养。每天观察细胞病变（CPE），72h后，放入－20℃冰箱，冻融3次，每次冻融过程中剧烈晃动培养瓶，使细胞瓶底部培养物脱落。混合收获的病毒液，12 000r／min离心10min，收集上清液。盲传5代后，病毒液分装，于－80℃保存。

1.2.3胶体金检测 采用Anigen Rapid Rota Ag Test Kit对收获的病毒液进行检测。将收获的病毒液加入胶体金的样品孔内，静置5min判定结果。

1.2.4免疫荧光检测 将MA104细胞以2× 105个／mL接种于6孔板内，24h后按1.2.2方法进行病毒接种，同时设细胞对照。24h后弃去培养液，用PBS洗2遍，然后加入固定液，室温静置10min。吸出固定液，每孔用PBS洗涤2遍，加入1%马血清37℃封闭20min。弃去封闭液加入轮状病毒单克隆抗体37℃孵育30min。弃液，用PBS洗2遍，加入FITC标记兔抗鼠二抗，37℃孵育30min。弃液，PBS洗2遍。加入PBS在荧光显微镜下观察。

1.2.5实时荧光定量RT－PCR检测 将病毒液按RNeasy?Mini Kit说明书提取RNA，以提取的RNA为模板进行实时荧光定量RT－PCR扩增。反应体系25μL：无菌无核酸酶水7μL，RT－PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，荧光探针2.5μL，模板2μL。反应条件：42℃5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火35s，共40次。

1.2.6引物设计与合成 根据GenBank中收录的猪A群轮状病毒VP4、VP6和VP7基因序列及已发表的相关文献［21］，设计3对引物，分别用于分离病毒VP4、VP6和VP7基因的扩增，引物信息见表1。引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2.7RT－PCR扩增 将病毒液按RNeasy?Mini Kit说明书进行RNA的提取。然后进行RT－PCR扩增。RT－PCR反应体系50μL：5×Green Buffer 10μL，2.5mmol／L dNTPs 5μL，5U／μL GoTaqDNA聚合酶2μL，10U／μL AMV反转录酶0.6μL，40U／μL RNA酶抑制剂0.4μL，10μmol／L上、下游引物各2.5μL，RNA模板4μL，ddH2O 23μL。RTPCR反应条件：42℃60min；95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2.5min（VP4）（VP6 1.5min、VP7 1min）35个循环；72℃延伸10min。PCR产物暂放4℃保存。将电泳后正确的产物切下，用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit试剂盒回收目的DNA片段。将回收的DNA片段与pEASY－T3载体相连。最后进行菌落PCR鉴定。将鉴定正确的单菌落送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

表1　引物信息Table 1 Primer information

1.2.8基因型鉴定与序列分析 将分离株VP4、VP6和VP7基因测序的结果在NCBI上进行BLAST比对。根据最新的轮状病毒分类方法，VP4和VP7基因核苷酸同源性大于80%，VP6基因核苷酸同源性大于85%为同一基因型，确定分离株各基因的基因型。从GenBank中选取轮状病毒不同基因型的毒株，使用Mega软件绘制VP4、VP6和VP7基因系统进化树，分析分离株进化关系。

2 结果与分析

2.1细胞病变结果

将病毒在MA104细胞盲传至第5代，接毒后48h细胞出现明显病变。正常MA104细胞生长良好，形态清晰（图1A）。接种病毒后的MA104细胞固缩，颗粒增多，最后细胞崩解脱落（图1B）。

图1　细胞病变结果（200×）Fig.1 Results of CPE（200×）

2.2胶体金检测结果

将病毒液加入胶体金的样品孔内，5min后胶体金上“C”和“T”均出现色带，表明试验结果成立，病毒液中含有轮状病毒抗原。

2.3间接免疫荧光检测结果

将病毒进行间接免疫荧光试验（IFA），在荧光显微镜下观察，细胞对照孔内未见荧光，背景干净（图2A）；感染的细胞胞浆内有绿色荧光（图2B），结果表明MA104细胞浆内含有轮状病毒。

2.4实时荧光定量RT－PCR检测结果

将病毒液进行实时荧光定量RT－PCR扩增。扩增结果见图3。由图3可知，阴性对照无Ct值，无特定扩增曲线；病毒液Ct值≤30并出现特定的扩增曲线。结果表明，病毒液中含有轮状病毒特异性的核酸片段。

图2　IFA检测结果（200×）Fig.2 Results of IFA（200×）

图3　实时荧光定量RT－PCR检测结果Fig.3 The results of Real－time RT－PCR

2.5RT－PCR鉴定

提取分离株基因组进行RT－PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示在约2 000、1 500和1 000bp处存在目的条带（图4），分别与预期VP4（2 362bp）、VP6（1 356bp）和VP7（1 062bp）基因片段大小相符。将鉴定正确的菌落测序，初步鉴定分离株为猪轮状病毒，简称为BJ株。

2.6基因型鉴定与序列分析

猪轮状病毒的VP4基因决定P基因型的分型。分离株VP4基因与猪A型轮状病毒FGP36日本株和RVA／Pig－wt／BEL／12R041／2012／G9P［13］比利时株同源性为90.0%和89.0%，这两毒株均为P［13］基因型，核苷酸同源性大于80.0%，因此分离株为P［13］型（图5）。

图4　轮状病毒VP4、VP6、VP7基因RT－PCR扩增结果Fig.4 RT－PCR amplification ofVP4，VP6andVP7genes of RV

图5　轮状病毒VP4基因系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of the full length nucleotide sequences ofVP4gene from RV

猪轮状病毒的VP6基因为群抗原，具有群特异性，基因分型为I。分离株VP6基因与猪A型轮状病毒TA－4－1中国株和RVA／Pig－wt／THA／CMP40／08／2008／G3P［23］泰国株同源性分别为97.0%和 94.0%，毒株均为猪A型轮状病毒I5型，核苷酸同源性大于85.0%，因此分离株为猪A型轮状病毒I5型（图6）。

图6　轮状病毒VP6基因系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of full length nucleotide sequences ofVP6gene from RV

猪轮状病毒的VP7基因决定G基因型的分型。分离株VP7基因与猪A型轮状病毒ZJhz13－3中国株和Rotavirus A EC2184／ECU／G11P［6］厄瓜多尔株的同源性分别为96.0%和92.0%，毒株均为A型轮状病毒G11型，基因核苷酸同源性大于85.0%，因此分离株为G11型（图7），经序列比对分析确定该分离株名称为Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］。

图7　轮状病毒VP7基因的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of full length nucleotide sequences ofVP7gene from RV

3 讨 论

猪轮状病毒最初适应在经胰酶预处理的猪原代肾细胞上培养。Bohl等［22］用非洲猴肾细胞系MA104成功对轮状病毒进行体外分离。后来相继有研究者使用人克隆细胞CaCo－2［23］、非洲绿猴肾细胞Vero［24］、恒河猴胎肾细胞Marc－145［13］、猪小肠细胞IRBSⅡ等成功分离到轮状病毒。胰酶是轮状病毒分离中重要的物质因素，轮状病毒难以在细胞上培养是由于RVVP4蛋白能抑制病毒感染力。胰酶能裂解轮状病毒外衣壳蛋白VP4并产生新的蛋白VP5（羧基端）和VP8（氨基端），从而使病毒具有了感染宿主细胞的能力［25］。感染前用胰酶进行预处理使病毒活化，也可在病毒吸附后把胰酶加入无血清的培养基中［1］。

Papp等［26］统计了1976—2011年间公开发表的关于猪A型轮状病毒的文章，统计结果显示，在全球范围内所有G基因型的毒株所占比例：G5（45.8%）、G3（11.2%）、G4（9.6%）；在全球范围内所有P基因型的毒株所占比例：P［7］（47.4%）、P［6］（15.9%）、P［13］（3.2%）。在亚洲地区G基因型的毒株所占比例：G5（29.4%）、G3（25.4%）、G9（11.37%）；在亚洲地区P基因型的毒株所占比例：P［7］（41.6%）、P［6］（9.92%）、P［23］（8.73%）。G5P［7］是流行最广泛的毒株。本研究分离株G11基因型亚洲由于未报道无法统计，占美洲报道的1.89%，欧洲报道的2.17%，分离株P［13］占亚洲报道的5.95%，占美洲报道的0.46%，占欧洲报道的8.06%。由此可知，分离株G11P［13］基因型无论在亚洲还是全球分布都较少。

本研究中的分离株VP4基因与猪A型轮状病毒FGP36日本株核苷酸同源性为90.0%，VP6基因与2015年提交序列的猪A型轮状病毒TA－4－1中国株核苷酸同源性为97.0%，VP7基因与2012年提交序列的猪A型轮状病毒ZJhz13－3中国株核苷酸同源性为96.0%。分离株除VP4基因与日本株同源性较高外，VP6和VP7基因均与中国分离株具有很高的同源性，但由于这两株分离株在Gen－Bank上只分别提交了VP6或VP7的基因序列，无法与这两株病毒进行全面的序列比对。

4 结 论

本研究为中国猪轮状病毒的流行病学调查和防控奠定了基础。但分离株Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］在全国的流行情况及与国内其他毒株的同源性还需进一步研究。

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（责任编辑 董晓云）

中图分类号：S852.65＋9.4

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3306－08

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.033

收稿日期：2016－05－11

基金项目：科技部科技基础性工作专项——动物及动物产品质量安全检测标准物质研制（2013FY113300－6）

作者简介：原 霖（1982－），男，辽宁鞍山人，硕士，研究方向：动物疫病诊断技术研究，E－mail：6428949＠163.com

通信作者：＊沈建忠（1963－），男，浙江桐乡人，博士，研究方向：动物及动物性食品中病原生物耐药性机理研究，E－mail：sjzh＠cau.edu.cn

Isolation and Identification of Porcine Group A Rotavirus BJ Strain

YUAN Lin1，2，HAN Tao2，NI Jian－qiang2，KANG Wen－hua2，WANG Bao－yue2，LI Xiao－xia2，CHEN Ya－na2，ZHAI Xin－yan2，SHEN Jian－zhong1＊
（1.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.OIEReferenceLaboratoryforPorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，ChinaAnimalDisease PreventionandControlCenter，Beijing102618，China）

Abstract：Rotavirus infections are a major cause of viral diarrheas in young animals and children.Isolation and identification of rotavirus make a contribution to epidemiological survey and molecular biology study.A strain of porcine rotavirus was isolated in MA104cell cultures from the intestinal contents of piglets with diarrhea in Beijing.The virus was identified to be porcine rotavirus by immunochromatography strip test，Real－time RT－PCR，immunofluorescence test and sequencing analysis.According to the sequence analysis，the virus was classified as group A porcine rotavirus，the genotype ofVP4，VP6andVP7genes belonged to P［13］，I5and G11，respectively.The virus was designated Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］.

Key words：porcine rotavirus；isolation；identification