结核感染T细胞斑点试验诊断肺结核的临床应用

蔺景双，蔺晨，郝兴亮，冯涛，王世寿

(胜利油田中心医院，山东东营257034)

结核感染T细胞斑点试验诊断肺结核的临床应用

蔺景双，蔺晨，郝兴亮，冯涛，王世寿

(胜利油田中心医院，山东东营257034)

目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)诊断肺结核的临床价值。方法选择疑似肺结核患者324例，均行全血T-SPOT.TB及结核菌素(PPD)试验，血清结核杆菌抗体(TB-AB)、痰涂片结核分枝杆菌检测以及支气管肺泡灌洗液(BALF)结核分枝杆菌检测，42例行肺组织病理学检查。临床确诊肺结核164例，均给予常规抗结核治疗，T-SPOT.TB阳性患者每隔30天复查1次T-SPOT.TB。比较各方法诊断肺结核的敏感性、特异性，观察T-SPOT.TB阳性患者随访30、60、90、120天时T-SPOT.TB阳性率变化。结果T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感性为95.1%，均高于其他方法(P均<0.05)；T-SPOT.TB、痰涂片结核分枝杆菌检测、BALF结核分枝杆菌检测、肺组织病理诊断特异性分别为91.3%、100%、100%、100%，明显高于PPD试验、血清TB-AB(P均<0.05)。T-SPOT.TB阳性患者127例，随访第30、60、90、120天时T-SPOT.TB阳性率分别为83.5%(106/127)、67.7%(86/127)、35.4%(45/127)、10.2%(13/127)。结论T-SPOT.TB诊断肺结核具有较高的敏感性及特异性。

肺结核；结核感染T细胞斑点试验；结核杆菌；诊断

近几年来我国肺结核发病率呈明显上升趋势。目前肺结核诊断主要依据临床表现、影像学检查、结核菌素(PPD)试验、血清结核杆菌抗体(TB-AB)、痰涂片结核分枝杆菌检测以及支气管肺泡灌洗液(BALF)结核分枝杆菌检测等，但上述方法在检测时间及特异性、敏感性等方面均存在不足[1～4]。结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)是一种快速检测结核分枝杆菌感染的方法，近年来逐渐用于肺结核的诊断。本研究对324例疑似肺结核患者行T-SPOT.TB，并与其他实验室检查方法的诊断结果进行比较，探讨T-SPOT.TB诊断肺结核的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月～2015年10月胜利油田中心医院收治的疑似肺结核患者324例，男211例、女113例，年龄16～76岁、中位年龄53岁，其中呼吸内科209例、心内科14例、保健科26例、消化内科10例、风湿科65例，均有典型的肺结核临床表现及影像学特点，排除人免疫缺陷病毒(HIV)感染及应用免疫抑制剂(抗肿瘤化疗药及糖皮质激素)者。

1.2 肺结核实验室诊断方法 324例患者均行全血T-SPOT.TB及PPD试验，血清TB-AB、痰涂片结核分枝杆菌检测以及BALF结核分枝杆菌检测；42例行肺组织病理学检查。具体方法：①全血T-SPOT.TB：抽取静脉血4 mL，给予肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，得到外周血单个核细胞(PBMCs)；将PBMCs与结核特异抗原早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)分别加入预包被抗γ-干扰素(γ-INF)抗体的反应孔中，孵育过夜；PBS洗涤，加入二抗，第二次洗涤后加入底物显色，计数显色斑点数。如空白对照孔内斑点数<6个，任一实验孔斑点数-空白对照孔斑点数<6个，判定为阳性；如空白对照孔内斑点数≥6个，任一实验孔斑点数≥空白对照孔斑点数的2倍，亦判定为阳性；其余结果为阴性。T-SPOT.TB试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司。② PPD试验：将5 IU卡介苗纯蛋白衍生物稀释剂注入前臂掌侧皮内，注射后72 h观察结果，测量硬结直径。硬结直径<5 mm为阴性，5～9 mm为阳性，10～14 mm为中度阳性，15～19 mm或>20 mm或有水泡、坏死为强阳性。③血清TB-AB检测：应用结核分枝杆菌抗体检测试剂盒(胶体金法)，步骤参照试剂盒说明书。测试结果在5～10 min内读取,出现两条紫红色条带为阳性，仅质控区(c)出现一条紫红色条带为阴性。④痰涂片结核分枝杆菌检测：采用萋尼染色法，取新鲜痰液涂片，抗酸染色，首先镜检找到可能抗酸性杆菌，再进一步鉴定。⑤ BALF结核分枝杆菌检测：选择病变肺段进行灌洗，经支气管镜活检孔通过一细硅胶管注入利多卡因2 mL，进行灌洗肺段局部麻醉，再经硅胶管注入常温生理盐水，总量100～200 mL，分3～5次序贯灌入。每次灌入一份生理盐水后，负压吸出BALF。灌洗液涂片镜检查找结核杆菌。⑥肺组织病理学检查：经支气管镜对肺内病灶钳取活组织进行病原学及病理学检查，抗酸染色发现结核杆菌，组织表现为渗出型病变、增殖型病变、干酪样坏死。

1.3 肺结核的临床诊断 ①菌阳肺结核根据卫生部《WS288-2008肺结核诊断标准》[1]。确诊菌阳肺结核12例，男8例、女4例，年龄52～76岁。②参照2001年中华医学会结核病学分会制定的菌阴肺结核诊断标准[2]，诊断菌阴肺结核152例，男83例、女69例，年龄16～73岁。③参照文献[1]标准确诊活动性肺结核12例，男8例、女4例，年龄52～76岁。④临床诊断活动性肺结核的标准：符合典型结核病临床及影像学表现，但未获得病原学及病理学证实，疑似结核病患者经诊断性抗结核治疗或随访观察，临床可排除其他非结核性疾病。临床诊断活动性肺结核152例，男94例、女58例，年龄16～73岁。肺结核确诊患者均给予常规抗结核治疗，其中T-SPOT.TB阳性者每隔30天复查T-SPOT.TB。比较各诊断方法确诊肺结核的例数，计算诊断敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率，观察T-SPOT.TB阳性患者随访30、60、90、120天时T-SPOT.TB阳性率变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

324例疑诊肺结核患者中临床确诊肺结核164例，其中临床诊断活动性肺结核152例、确诊活动性肺结核12例，各诊断方法确诊肺结核例数见表1。T-SPOT.TB 的诊断敏感性为95.1%，均明显高于其他方法(P均<0.05)；T-SPOT.TB、痰涂片诊断特异性分别为91.3%、100%，均明显高于其他方法(P均<0.05)；见表2。8例T-SPOT.TB假阴性患者均为60岁以上老年人，且多伴有2型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、慢性肾功能不全等基础疾病。162例T-SPOT.TB阳性者中127例坚持复查120天，30、60、90、120天时T-SPOT.TB阳性率分别为83.5%(106/127)、67.7%(86/127)、35.4%(45/127)、10.2%(13/127)。

表1 各诊断方法确诊肺结核例数(例)

注：42例行组织病理检查。

表2 各诊断方法检查结果比较(%)

注：与T-SPOT.TB比较，*P<0.05。

3 讨论

目前肺结核诊断主要依据临床表现、影像学检查、TB-AB、细菌学检查等进行综合判断[3]。PPD、TB-AB、痰涂片等是目前诊断肺结核常用的方法，这些方法虽然能够做到快速检测，但在特异性和敏感性方面存在不足[4]。我国人口出生后均要接种卡介苗，而卡介苗接种与PPD试验存在交叉反应[5]，且易导致TB-AB检测阳性率、敏感性、特异性下降；痰涂片找结核菌虽特异性很高，但阳性率低，主要为患者留痰方法不当、留痰标本不合格所致。结核分枝杆菌培养是诊断肺结核的可靠方法，但所需时间较长，不能及时诊断[6]。

机体感染结核杆菌后产生特异效应T淋巴细胞，致敏T淋巴细胞再次受结核分枝杆菌特异性抗原刺激时，可活化分泌释放γ-INF。检测机体γ-INF水平和(或)计数分泌γ-INF的T淋巴细胞，可了解机体感染结核分枝杆菌后的免疫应答状态，辅助诊断结核病。T-SPOT.TB是一种计数单个结核特异的效应T细胞的酶联免疫斑点(ELISPOT)检测方法，可计录每个活化的结核特异效应T细胞，其检测原理是以ESAT-6和CFP-10结核分枝杆菌特有的基因序列作为刺激抗原，刺激外周血单个核细胞；若机体存在结核感染的特异效应T细胞，经刺激抗原刺激后会产生大量γ-INF，通过ELISPOT技术可间接测定特异的效应T细胞数量，以此判断机体存在结核感染[7]。T-SPOT.TB能准确判断是否存在结核杆菌感染，敏感性及特异性较高[8]。本研究结果显示，T-SPOT.TB临床确诊肺结核的敏感性为95.1%，与国内外学者研究结果(81.1%～98.4%)一致[9～12]。非肺结核患者T-SPOT.TB检测特异性为91.3%，国内学者的研究结果为65.5%～92.1%[11～14]，数值波动范围较大，有待于大样本研究以验证该结果。本研究中PPD、血清TB-AB、痰涂片结核分枝杆菌、BALF结核分枝杆菌、肺组织病理检测的敏感性均明显低于T-SPOT.TB，且假阴性率均明显高于T-SPOT.TB，PPD、血清TB-AB假阳性率也明显高于T-SPOT.TB；痰涂片结核分枝杆菌、BALF结核分枝杆菌、肺组织病理检测的特异性与T-SPOT.TB检查结果比较无明显差异，但其敏感性较低，假阴性率较高；PPD、血清TB-AB的特异性均明显低于T-SPOT.TB。以上研究结果提示T-SPOT.TB在诊断肺结核方面较其他检测方法有明显的优势。另外，本研究结果显示经抗结核治疗后T-SPOT.TB阳性患者逐渐转阴，其转阴速度与临床症状转变趋势一致，提示可根据T-SPOT.TB是否转阴判断抗结核治疗效果。

本研究中T-SPOT.TB假阳性率为8.8%，假阴性率为4.9%。8例假阴性患者均患有慢性疾病，且为老年患者，其本身免疫功能降低，抑制T淋巴细胞的免疫功能，影响T-SPOT.TB的检查结果。T-SPOT.TB试剂盒在诊断活动性肺结核方面仍值得探讨，该方法目前只能用于检测是否存在结核感染，并不能鉴别活动性肺结核和结核潜伏感染[15,16]。如果临床上考虑患者为陈旧性肺结核，而T-SPOT.TB阳性，是否给患者抗结核治疗仍值得探讨。

综上所述，T-SPOT.TB诊断肺结核具有较高的敏感性及特异性，且假阳性率及假阴性率低。

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