碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

户小伟，李巍，韦达隆，劳山

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

户小伟，李巍，韦达隆，劳山

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响，并探讨其最佳作用浓度。方法采用体外全血贴壁法培养兔BMSCs，进行表面抗原(CD29、CD44、CD45，采用流式细胞术)及成软骨(HE染色和阿尔新蓝染色)、成骨[茜素红染色及碱性磷酸酶(ALP)染色]分化潜能鉴定。取第2代BMSCs，加入含0、1、5、10、50、100 ng/mL bFGF的成骨诱导液，分别于培养第4、7、10、14天采用PNP比色法检测ALP表达，采用放射免疫分析法检测骨钙素(OC)表达。结果细胞表面抗原CD29阳性表达率为92.23%，CD44阳性表达率为80.01%，CD45阳性表达率为1.91%；HE染色见细胞形态为多角形或多边形，有多个凸起，核周细胞质内可见黑色颗粒，阿尔新蓝染色可见细胞间大量天蓝色物质弥漫分布；茜素红染色可见大量红色钙结节，ALP染色可见细胞质中出现棕褐色的颗粒和块状沉淀；证实分离培养的细胞为BMSCs，并具有成软骨和成骨分化潜能。随着作用时间的延长，BMSCs经不同浓度bFGF作用后ALP及OC表达均呈升高趋势。相同作用时间下，BMSCs经50 ng/mL bFGF作用后ALP及OC表达均高于0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后(P均<0.01)。结论bFGF能促进BMSCs向成骨细胞分化，并呈时间依赖性；其最佳作用浓度为50 ng/mL。

骨髓间充质干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；成骨分化；兔

骨组织工程技术是目前治疗骨坏死病变及修复骨缺损最有前景的方法，种子细胞作为组织工程的三要素之一，其选择和培养更是该技术最基本的环节。骨髓间充质干细胞(BMSCs)有多向分化的能力，被认为是最具潜能的种子细胞[1]。但是自体BMSCs取材有限，因此如何短期内促进其增殖以达到治疗数量并增强其成骨效果，是目前所面临的问题。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是骨修复再生过程中重要的生长因子，但是关于其对BMSCs成骨分化的影响及最佳作用浓度研究较少。为此，我们于2015年7～10月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：出生2～3 d的新西兰白兔10只，雌雄不限，均购于广西医科大学实验动物中心。主要试剂：培养基(DMEM-LG、DMEM-HG)购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季清生物工程材料有限公司，β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸均购于美国Sigma公司，TritonX-100购于北京Solarbio公司，转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、bFGF均购于美国Peprotech公司，CD44抗体、CD45抗体、二抗sc-2010均购于美国Santa Cruz 公司，CD29-FITC购于美国Millipore公司，碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。主要仪器：倒置生物显微镜购于日本Olympus公司，酶标光度计(MK3型)购于美国Thermo Labsystems公司，流式细胞仪购于美国BD公司，紫外可见光分光光度计购于上海棱光技术有限公司，CO2恒温培养箱购于美国SHEL LAB公司。

1.2 兔BMSCs分离培养及鉴定 取10只出生2～3天的新西兰白兔，予颈椎脱臼处死，无菌条件下取出双侧股骨。在含15% FBS的DMEM-LG培养基中反复冲洗髓腔，将冲出物及培养基复合液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。用含15% FBS的DMEM-LG培养基重悬细胞，吹打均匀，按1×106/mL接种于培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。当细胞融合至80%以上，弃去培养液，用PBS冲洗2遍，加入0.25%胰酶1 mL消化约3 min。待显微镜下发现细胞团缩后，用含15% FBS的DMEM-LG培养基终止消化。充分吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入培养基吹打均匀，按1∶2接种于培养瓶中进行传代培养。40倍倒置相差显微镜下观察细胞生长及形态学变化。结果显示，原代BMSCs接种24 h可见贴壁细胞，为梭形或三角形，呈集落样生长，接种7～9天可融合至80%以上。传代BMSCs细胞生长迅速，多数在接种12 h内贴壁生长，接种3～4天可融合至80%以上，为典型的长梭型，呈鱼群状生长。

1.2.1 BMSCs表面抗原鉴定 采用流式细胞术。取融合至90%以上的第3代BMSCs，用含Ca2+、Mg2+的PBS冲洗2遍，胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，FACS buffer冲洗2遍[2]。再次1 000 r/min离心5 min，FACS buffer重悬细胞。取4支EP管，分别编号为A、B、C、D，均加入200 μL细胞悬液。A管加入10 μL CD44抗体，B管加入10 μL CD45抗体，D管加入10 μL PBS作为阴性对照，4 ℃避光孵育40 min。离心后3管予FACS buffer重悬细胞，并加入20 μL荧光二抗。C管加入10 μL用FITC标记的CD29抗体，4管在4 ℃条件下避光孵育20 min，1 000 r/min离心5 min，FACS buffer重悬细胞。上流式细胞仪检测BMSCs表面CD29、CD44、CD45表达情况，以cot fit软件分析结果。BMSCs鉴定标志为CD29、CD44高表达，CD45低表达。结果显示，细胞表面抗原CD29阳性表达率为92.23%、CD44阳性表达率为80.01%，CD45阳性表达率为1.91%，证实其为BMSCs。

1.2.2 成软骨分化潜能鉴定 取融合至90%以上的第2代BMSCs，给予成软骨分化诱导液2 mL(含10% FBS的DMEM-HG培养基，加入10 ng/mL TGF-β1、10 ng/mL IGF-1、37.5 μg/mL维生素C、6.25 μg/mL转铁蛋白)进行培养，14天后常规进行HE染色和阿尔新蓝染色，400倍光学显微镜下观察染色情况并拍照记录。HE染色显示核周细胞质内出现黑色颗粒、阿尔新蓝染色显示细胞间出现天蓝色物质则表明BMSCs出现软骨分化。结果显示，HE染色可见细胞形态为多角形或多边形，有多个凸起，核周细胞质内可见黑色颗粒；阿尔新蓝染色可见细胞间大量天蓝色物质弥漫分布；证实BMSCs具有成软骨分化潜能。见插页Ⅰ图1。

1.2.3 成骨分化潜能鉴定 取融合至90%以上的第2代BMSCs，给予成骨分化诱导液(含10% FBS的DMEM-HG培养基，加入4×10-6g/L地塞米松、0.5 g/L维生素C、1 g/L β-磷酸甘油钠)进行培养，14天后常规行茜素红染色及ALP染色，200倍光学显微镜下观察染色情况并拍照记录。茜素红染色显示红色钙结节，ALP染色显示细胞呈粉红色或红色、细胞核为蓝色则表明BMSCs出现成骨分化。结果显示，茜素红染色可见大量红色钙结节，ALP染色可见细胞质中出现棕褐色的颗粒和块状沉淀；证实BMSCs具有成骨分化潜能。见插页Ⅰ图2。

1.3 bFGF对BMSCs成骨分化的影响 取第2代BMSCs，调整细胞密度为1×104/L，接种于24孔板，每孔200 μL。常规培养细胞贴壁融合至90%以上，将细胞随机分为6组，分别加入含0、1、5、10、50、100 ng/mL bFGF的成骨诱导液(成分同1.2.3)。分别于培养第4、7、10、14天抽取培养液200 μL，采用PNP比色法检测ALP表达，放射免疫分析法检测骨钙素(OC)表达，严格按照试剂盒说明书操作。

2 结果

随着作用时间的延长，BMSCs经不同浓度bFGF作用后ALP及OC表达均呈升高趋势。相同作用时间下，BMSCs经50 ng/mL bFGF作用后ALP及OC表达均高于0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后(P均<0.01)。见表1、2。

表1 BMSCs经不同浓度bFGF作用后ALP表达

注：与0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后相同时间比较，*P<0.01。

表2 BMSCs经不同浓度bFGF作用后OC表达

注：与0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后相同时间比较，*P<0.01。

3 讨论

BMSCs具有干细胞的共同特性，能够自我增殖并具有多向分化潜能；其在特定条件和细胞因子诱导下，可分化为中胚层成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等，也可跨越胚层界限，向外胚层神经元样细胞、神经胶质细胞分化[2, 3]。同时BMSCs满足了组织工程种子细胞的基本要素：①具有良好的成骨能力，增殖能力强；②容易建立较稳定的标准细胞系，易于分离培养；③取材方便，抗原性低，对机体损伤小[4]。将体外培养的BMSCs植入体内可修复骨组织缺损，为骨缺损、骨疾病的再生修复开辟新途径。Ma等[5]建立股骨头缺血性坏死的动物模型，将骨形成蛋白2和血管生长因子修饰后的自体BMSCs植入病灶，发现有明显的新骨形成。但单独使用BMSCs取材数量有限，且难以达到满意的成骨效果。本研究分离兔BMSCs后采用体外全血贴壁法进行培养，鉴定结果显示其高表达CD29、CD44，低表达CD45，且染色结果显示其具有成软骨和成骨分化潜能，证实分离的细胞为BMSCs。生长因子是一类具有控制细胞生长和活性，促进或抑制细胞增殖、分化、迁移和基因表达等生物效应的多肽类物质[6]。目前发现的骨生长因子主要包括骨形成蛋白、转化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和bFGF、血小板源生长因子、胰岛素生长因子等[7]。bFGF可刺激成纤维母细胞的生成，是目前发现的最有效的血管生成因子之一，能促进骨、软骨、神经和软组织修复[8，9]；可激发促进BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能，具有体内外诱导成骨和成血管作用，因此可以促进骨修复[10，11]。Kuroda等[12]研究发现，bFGF能明显增加BMSCs的增殖速度。郑磊等[13]研究也证实，bFGF可增加骨髓基质细胞的贴壁率，随着bFGF浓度(0～10 ng/mL)的上升，细胞贴壁率逐渐升高。

ALP在多种人体组织细胞内均有表达，当细胞成骨活动时，其ALP水平和活力均升高，可作为反映细胞成骨活性的相关指标[14]。OC是由成骨细胞分泌的一种活性多肽，在骨代谢调节中起重要作用，其水平亦能反映成骨细胞活性。本研究结果显示，随着作用时间的延长，BMSCs经不同浓度bFGF作用后ALP及OC表达均呈升高趋势，说明bFGF促进BMSCs成骨分化的作用呈时间依赖性；但相同作用时间下BMSCs经50 ng/mL bFGF作用后ALP及OC表达均高于0、1、5、10、100 ng/mL bFGF作用后，说明bFGF的最佳作用浓度为50 ng/mL。Varkey[15]研究发现，bFGF的浓度以10 ng/mL为分界，低于10 ng/mL可促进钙盐沉积，而高于10 ng/mL则表现为抑制作用。在对人牙组织干细胞的研究中发现，bFGF对ALP的表达有抑制作用[16]。因此，bFGF的浓度可能会对BMSCs的生物特性和分化能力产生不同影响；低浓度时可促进钙盐沉积，而高浓度时则可抑制成骨活性[17]。

综上所述，bFGF能促进BMSCs向成骨细胞分化，并呈时间依赖性；其最佳作用浓度为50 ng/mL。bFGF与BMSCs的相互作用过程相当复杂，加入因子的时间、剂量、作用持续时间等目前尚不明确，仍需进一步研究。

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Influence of basic fibroblast growth factor on differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts

HUXiaowei1,LIWei,WEIDalong,LAOShan

(FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiation of the rabbit′s bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into osteoblasts, and to explore the optimal concentration of bFGF. Methods The BMSCs were cultured by the whole blood adherent method and then surface antibody (CD29, CD45 and CD45 by flow cytometry) and osteoblasts (by HE staining and alcian blue staining), and cartilage cells [by alizarin red staining and alkaline phosphatase (ALP) staining] were identified. The 2nd generated BMSCs were cultured with different concentrations (0， 1, 5, 10, 50, and 100 ng/mL) of bFGF. detecting alkaline phosphatase (ALP) with PNP colorimetric method and osteocalcin (OC) expression with radioimmunoassay (RIA) method on day 4, 7, 10 and 14 of culture. Results The positive rate of cell surface antigen CD29 was 92.23%, CD44 was 80.01%, and CD45 was 1.91%. HE staining showed that the cell morphology became polygonal or polygonal and there were multiple protrusions, the black particles could be seen within perinuclear cytoplasm. Alcian blue staining showed that a large number of azure materials diffused. A large number of red calcium nodules were seen by Alizarin red staining. The brown granules and massive precipitation in the cytoplasm were seen by ALP staining, which confirmed the cells were BMSCs with the potential of differentiating into cartilages and osteoblasts. The expression of ALP and OC in the 2nd generation of BMSCs was increased with different concentrations of bFGF as the time passes by. The expression of ALP and OC in BMSCs treated with 50 ng/mg bFGF was higher than that of BMSCs treated with 0, 1, 5, 10 and 100 ng/mL bFGF at the same time (allP<0.01). Conclusion The bFGF promotes BMSCs differentiating into osteoblasts which is in a time-dependent manner and the optimal concentration is 50 ng/mg.

bone marrow mesenchymal stem cells; basic fibroblast growth factor; osteoblast differentiation; rabbit

广西中医药民族医药自筹经费科研课题(GZZC15-33)。

户小伟(1982-)，男，主治医师，研究方向为骨髓间充质干细胞的诱导分化及骨坏死修复。E-mail： huxiaowei555@qq.com

李巍(1984-)，男，主治医师，研究方向为退行性关节炎的发病机制、骨髓间充质干细胞对骨坏死及软骨损伤的修复。E-mail： lw5hj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.003

R329

A

1002-266X(2016)48-0008-04

2016-02-15)