高效液相色谱法同时测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量

王英，洪伟勇，王金明

1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053； 2.台州市立医院药剂科，浙江 台州 318000

高效液相色谱法同时测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量

王英1，2，洪伟勇2，王金明2

1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053； 2.台州市立医院药剂科，浙江 台州 318000

目的：建立高效液相色谱法测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量。方法：使用ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱。以甲醇-0.2%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温为30℃，检测波长为254 nm，进样量为10 μL。结果：原儿茶酸在0.017 0～1.70 mg/mL的浓度范围内线性关系良好，加样回收率为97.83%，RSD为2.31%；绿原酸在0.015 2～1.52 mg/mL的浓度范围内线性关系良好，加样回收率为96.87%，RSD为1.69%。结论：高效色相色谱法测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的方法具有专属性强、回收率高、重复性好等突出特点，能够比较快速、准确地测定大血藤药材中原儿茶酸和绿原酸的含量。

高效液相色谱法；大血藤；原儿茶酸；绿原酸

大血藤为木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.) Rehd.et Wils的干燥藤茎，具有活血、祛瘀、清热解毒等功效，主要用于跌打损伤、风湿痹痛、痛经、肠痈腹痛等[1～2]。现代药理学研究表明，大血藤含有的化学成分具有较明显的抗炎、抑菌、镇痛、免疫调节等作用[3]。大血藤中含有的原儿茶酸和绿原酸具有多方面的药理活性，但关于其含量测定的报道相对较少。笔者采用高效液相色谱法测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量，以期为控制大血藤药材质量提供依据。

1 仪器与药品

1.1 仪器 安捷伦高效液相色谱仪(包括柱温箱，自动进样器，泵，紫外检测器)；BT25S型电子分析天平(北京赛多利斯分析仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，2500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DFT-50手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

1.2 药品 原儿茶酸(中国食品药品检定所研究院，110761-201409)；绿原酸(中国食品药品检定所研究院，110542-201410)；甲醇(色谱纯，西陇化工有限公司，20140318)；甲酸(Sigma公司，分析纯)；大血藤药材购自河北安国药材市场，经鉴定为木通科植物大血藤的干燥藤茎；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Dkima ODS2 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。以甲醇(A)-0.2%甲酸水(B)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：10%～25%B(0～20 min)；25%B(20～35 min)；25%～10%B(35～40 min)。流速：1 mL/min，检测波长：254 nm，柱温：30℃。

2.2 混合对照品溶液的制备 取原儿茶酸、绿原酸对照品适量，精密称定，将其置于50 mL量瓶中，加适量的甲醇使其溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.170 mg/mL、0.152 mg/mL的混合对照品储备溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取大血藤药材饮片适量，烘干、粉碎、过筛，取粉末(过65目)约0.5 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密称定，超声提取(功率300 W，频率50 kHz)30 min，放凉，再精密称定，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL的量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，照2.1项的色谱条件测定原儿茶酸和绿原酸的峰面积。以原儿茶酸、绿原酸浓度对其峰面积绘制标准曲线，可得原儿茶酸的回归方程为：Y1=76493X-48953，r= 0.999 6。绿原酸的回归方程为：Y2=69821X-49731，r= 0.999 4。结果表明，原儿茶酸在0.017 0～1.70 μg的范围内呈现良好的线性关系；绿原酸在0.015 2～1.52 μg的范围内呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取大血藤供试品溶液，连续进样6次，每次进样量均为10 μL，按照2.1项的色谱条件测定，计算原儿茶酸峰面积的RSD值为1.97%，绿原酸峰面积的RSD值为1.75%。结果表明，精密度良好，符合含量测定的基本要求。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按照2.1项的色谱条件测定，计算原儿茶酸峰面积的RSD值为1.99%，绿原酸面积的RSD值为2.03%，结果表明，原儿茶酸和绿原酸在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验 取同一批大血藤药材粉末(过65目)，按照2.3项的方法平行制备6份样品，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按照2.1项的色谱条件测定，计算原儿茶酸峰面积的RSD值为1.67%，绿原酸峰面积的RSD值为1.46%。结果表明，用该方法测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量，重复性较好。

2.8 加样回收率试验 取同一批已知原儿茶酸和绿原酸含量的大血藤药材粉末(过65目)6份，每份约0.2 g，精密称定，分别加入混合对照品溶液适量，按照2.3项的方法制备溶液，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按照2.1项的色谱条件测定，计算回收率，结果见表1、表2。

表1 原儿茶酸加样回收率 %

表2 绿原酸加样回收率 %

2.9 样品含量测定 根据已建立的含量测定方法，取3批大血藤药材粉末(过65目)，每批3份，称取适量，按照2.3项的方法制备样品，并根据2.1项的色谱条件测定其峰面积，分别代入线性回归方程，计算大血藤药材中原儿茶酸和绿原酸的含量，结果见表3、表4。

表3 原儿茶酸含量测定结果(n=3) %

表4 绿原酸含量测定结果(n=3) %

3 讨论

现代药理学研究结果表明，大血藤中含有多种化学物质，其中所含有的原儿茶酸具有较强的抗菌作用，对大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌及枯草杆菌等均有不同程度的抑菌作用；绿原酸具有抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂等作用[4～6]。因而建立大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量测定方法，可为控制大血藤药材的质量提供依据。

本研究分别考察了加热回流提取法、超声提取法的效果，结果显示，2种方法提取的原儿茶酸和绿原酸含量无统计学差异，但受热时间及温度对原儿茶酸和绿原酸含量的影响有较大的差异，受热时间越长、温度越高，原儿茶酸和绿原酸含量越低，故本研究采用超声提取。本研究同时对流动相的种类及比例进行了考察，结果显示，采用甲醇和0.2%甲酸水作为流动相，并采用梯度洗脱时，可获得出峰时间、分离度及峰形等均较好的图谱。

综上所述，笔者建立的高效色相色谱法测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的方法，具有专属性强、回收率高、重复性好等突出特点，能够比较快速、准确地测定大血藤药材中原儿茶酸和绿原酸的含量，可为大血藤药材质量的评定提供一定的依据。

[1]李宛蓉，桂双英，王举涛，等.不同产地大血藤药材指纹图谱研究及红景天苷和绿原酸的含量测定[J].安徽中医药大学学报，2014，33(6)：82-86.

[2]丁越，张永，丁文平，等.HPLC测定大血藤药材中绿原酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(4)：99-102.

[3]李霞，杨颖博，李君丽，等.HPLC法同时测定皱皮木瓜中原儿茶酸和绿原酸的含量[J].中国医药导报，2012，9 (34)：110-112.

[4]韦建华，李耀华，梁臣艳，等.HPLC测定桑叶配方颗粒中原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(3)：93-95.

[5]周燕园.HPLC测定醋五味子配方颗粒中的原儿茶酸和绿原酸[J].华西药学杂志，2014，29(6)：688-690.

[6]郭晓璐，师子明，齐文，等.刺五加果TLC鉴别及原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷的含量测定[J].沈阳药科大学学报，2015，32(8)：618-622.

（责任编辑：吴凌）

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0256-7415（2016）02-0241-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.093

2015-10-10

王英（1982-），女，主管中药师，主要从事药物方面的研究工作。