肝细胞肝癌中极性蛋白AF-6mRNA的表达及对侵袭的影响分析

孙鹏宋远周晓晶

肝细胞肝癌中极性蛋白AF-6mRNA的表达及对侵袭的影响分析

孙鹏1宋远1周晓晶2

目的 探讨肝细胞肝癌中极性蛋白AF-6mRNA的表达及其对侵袭的影响。方法 采用实时定量PCR检测的方法，对28对癌细胞、ANLT及不同细胞系中的AF-6mRNA表达水平进行检测，分析AF-6mRNA对侵袭的影响。结果 26例肝细胞肝癌中AF-6mRNA呈现低表达，发生率为92.9%；肝癌细胞株中AF-6mRNA表达低于正常杆细胞株（P＜0.05）；低侵袭转移能力细胞系中AF-6mRNA表达高于高侵袭转移能力细胞系（P＜0.05）。结论 肝细胞肝癌中AF-6mRNA低表达可能与高侵袭能力有关。

肝细胞肝癌；AF-6mRNA；侵袭

肝细胞癌术后复发转移率较高，会影响患者预后。当前，临床上尚未寻找到有效的方法，对术后复发转移进行控制[1]。AF-6是一种极性蛋白，为细胞紧密连接的成分[2]。有研究认为，在胰腺癌的侵袭转移中，AF-6mRNA发挥着重要的作用[3]。但临床上针对其在肝细胞肝癌中的表达及侵袭转移中影响的研究仍较少[4]。基于此，本研究检测了癌细胞、ANLT及不同细胞系中的AF-6mRNA表达水平，分析其对侵袭转移的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2015年6月～2016年6月本院收治的28对肝细胞肝癌患者的肝癌组织及癌旁组织标本。28例标本中，男20例，女8例；患者平均年龄（45.3±2.4）岁，平均肿块大小（3.1±0.9）cm。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 购自上海生命技术科学院的正常肝细胞株L02、肝癌HepG2、HCCLM3等；购自罗氏公司的Faststart Universal SYBRGreen Master瑞士试剂盒；购自Gibco公司的Taq DNA聚合酶等。

1.2.2 培养细胞系 分别复苏、培养、传代并冻存人肝L02细胞及肝癌HepG2、HCCLM3等。

1.2.3 提取肝癌组织标本及细胞株总RNA 将1.0 ml裂解液溶入研磨好的新鲜肝癌及ANLT标本中，以移液器进行吹打；将0.2 ml氯仿溶入，进行15 s剧烈震荡，静置3 min。做10 000 r离心处理，持续15 min。在新管中转移上层水相，溶入0.5 ml异丙醇沉淀RNA，静置10 min；做10 000 r离心处理，持续10 min，将上清液移去，将100 μl无RNA酶水溶入，充分溶解后，置入零下80℃冰箱中保存。

1.2.4 定量PCR检测 按照GeneBank数据库中人AF-6基因的序列，内参为人GAPDH，交由上海生工生物技术公司合成，严格按照试剂盒使用说明书进行操作。PCR反应：95℃预变性，持续10 min；95℃变性，持续15 s；60℃退火，持续60 s；72℃延伸，持续30 s，持续40个循环。

1.3 统计学分析

以SPSS 19.0软件进行统计分析，数据满足正态且方差齐性时，以独立样本t检验；数据满足正态但方差不齐时，以校正t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AF-6mRNA在肝癌组织中的表达

本组28对组织标本中，26例肝细胞肝癌中AF-6mRNA呈现低表达，发生率为92.9%。

2.2 不同细胞株中AF-6mRNA表达水平

设正常肝细胞株L02相对表达量为1。肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H的AF-6mRNA表达分别为（0.6±0.1）、（0.2±0.1）、（0.3±0.1），均低于正常杆细胞株，差异有统计学 意 义（t=25.298、50.596、44.272，P=0.000、0.000、0.000）；低侵袭转移能力细胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表达高于高侵袭转移能力细胞系HCCLM3、MHCC97-H，差异有统计学意义（t=17.889、13.416，P=0.000、0.000）。

3 讨论

仅有部分早期确诊的肝癌患者能及时进行手术治疗，延长生存时间，但整体上病死率仍居高不下[5]。影响肝癌患者预后的关键，

是较高的术后复发转移率。这就需要寻找肝细胞肝癌患者术后潜在复发转移分子机制。

AF-6为极性蛋白，在维持细胞发育、修复损伤、保持组织完整性中发挥着重要的作用，且在卵巢癌、乳腺癌、白血病等多种癌症中存在异常表达[6]。有研究认为，在肿瘤的发生与发展过程中，极性蛋白的异常表达及错误定位具有重要意义[7]。但是，临床上仍缺乏对肝细胞肝癌中AF-6mRNA表达及其对侵袭影响的研究[8]。

本研究中，26例肝细胞肝癌中AF-6mRNA呈现低表达。提示在肝癌的发生与发展过程中，AF-6mRNA可能发挥着一定的作用。此外，肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H肝癌细胞株中AF-6mRNA表达低于正常杆细胞株（P＜0.05）。而且，低侵袭转移能力细胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表达高于高侵袭转移能力细胞系HCCLM3、MHCC97-H（P＜0.05）。由此可知，AF-6mRNA表达的变化可能与肝癌的侵袭转移有一定的相关性。此外，在肝细胞肝癌组织及细胞中，AF-6mRNA呈现低表达。因此AF-6mRNA表达的变化可能与肝癌的侵袭转移呈现负相关，提示AF-6可能会抑制肝细胞肝癌侵袭转移。

综上所述，肝细胞肝癌中AF-6mRNA低表达可能与高侵袭能力有关，今后可能发展成为分子、基因水平治疗肝细胞肝癌的潜在靶点，需引起高度关注。

[1] 吴天春，冯留顺，李捷，等. 极性蛋白AF-6mRNA在肝细胞肝癌中的表达及其对侵袭的影响[J]. 世界华人消化杂志，2015，23（31）：5045-5049.

[2] 陈志平. MiR-573/apoM/Bcl2A1途径对肝细胞凋亡和肝癌形成影响及其机制研究[D]. 广州：南方医科大学，2015：34-35.

[3] 李庆军. miR-10b通过抑制CADM1表达促进人肝细胞肝癌细胞侵袭和转移的机制研究[D]. 西安：第四军医大学，2013：15-16.

[4] 徐智，阳书华，王恺，等. 不同转移潜能肝癌细胞株GRP78的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响[J]. 中国病理生理杂志，2011，27（1）：108-112.

[5] 陈宏辉，彭蕾. 全反式维甲酸对肝癌细胞HepG2的分化、侵袭迁移的影响[J]. 世界华人消化杂志，2011，19（33）：3381-3389.

[6] 常远鸿，李汀，阴俊，等. 靶向沉默CXCR4基因抑制肝细胞癌侵袭体外研究[J]. 中华肿瘤防治杂志，2013，20（20）：1569-1573，1579.

[7] 周亮. Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移的机制研究[D]. 西安：第四军医大学，2013：12-13.

[8] 蒋成英. GA6与SHP2蛋白在肝细胞癌中的临床意义及其作用机制的研究[D]. 天津：南开大学，2012：8-9.

Expression of Polar Protein AF-6mRNA in Hepatocellular Carcinoma and Its Effect on Invasion

SUN Peng1SONG Yuan1ZHOU Xiaojing21Department of Gastroenterology, Jilin Provincial People’s Hospital, Changchun Jilin 130021, China, 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun Jilin 130017, China

Objective To investigate the expression of AF-6mRNA protein and its effect on the invasion of hepatocellular carcinoma. Methods Using real-time quantitative PCR detection method, the expression levels of AF-6mRNA in 28 pairs of cancer cells, ANLT and cell lines were detected, and the influence of AF-6mRNA on the invasion was analyzed. Results 26 cases of AF-6mRNA showed low expression in hepatocellular carcinoma, the incidence rate was 92.9%, the rod was significantly lower than the normal cell line AF-6mRNA expression in hepatocellular carcinoma cell line (P＜0.05), was obviously higher than that of invasion and metastasis of AF-6mRNA cells expressing ability in cell lines with low metastasis (P＜0.05). Conclusion Low expression of AF-6mRNA in hepatocellular carcinoma may be related to high invasive ability.

Hepatocellular carcinoma, AF-6Mrna, Attack

R735

A

1674-9308（2016）33-0237-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.33.137

吉林省卫生计生科研计划课题（20152084）

基金项目：吉林省卫生计生自筹经费课题（2015s2c06）

1 吉林省人民医院消化内科，吉林 长春 130021；2 长春中医药大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，吉林 长春 130017

周晓晶，E-mail：589632478@qq.com