Graves’ 眼病患者眼眶脂肪的形态学研究▲

叶 园 何剑峰 李凯军

(广西医科大学第一附属医院眼科，南宁市 530021)

·微创医学技术前沿·

Graves’ 眼病患者眼眶脂肪的形态学研究▲

叶 园 何剑峰*李凯军

(广西医科大学第一附属医院眼科，南宁市 530021)

目的 探讨Graves’眼病患者眼眶脂肪细胞的生物学特性。方法 选择12例行眼眶减压术的Graves’眼病患者为观察对象，术中取眼眶脂肪组织，采用酶消化培养法进行体外培养，行苏丹Ⅲ染色、病理学检查，观察活动期及非活动期Graves’眼病患者眼眶脂肪细胞的形态特征。结果 在体外培养过程中，眼眶脂肪组织中的多角形分枝细胞被诱导分化为成熟脂肪细胞。活动期患者眼眶脂肪组织中的多角形分枝细胞的数目明显多于非活动期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。Graves’眼病活动期患者的眼眶脂肪组织中存在大量的淋巴细胞浸润，非活动期患者的眼眶脂肪组织中无炎症细胞浸润。结论 Graves’眼病活动期患者眼眶脂肪组织增生比非活动期患者更活跃。

Graves’眼病；脂肪细胞；眼眶；淋巴细胞；眼外肌；形态学

Graves’眼病(Graves’ Ophthalmopathy，GO)又称为甲状腺相关眼病，是一种与自身免疫性甲状腺疾病密切相关的眼病，据统计30%～50%的Graves’病患者合并有GO[1]。Graves’眼病通常会影响患者眼眶软组织，包括眼外肌及眶周脂肪组织，导致眶内炎症及眼眶周围软组织广泛重塑，脂肪组织及眼外肌体积增加[2]。眼球突出是Graves’眼病患者特征性的临床表现，而眼眶脂肪组织扩张则被认为是造成眼眶内容物体积增加，最终导致眼球突出的重要因素。目前，眼眶脂肪细胞在Graves’眼病发生发展中的作用越来越受到关注。本研究采用酶消化培养法对Graves’眼病患者眼眶脂肪细胞进行培养和观察，以了解其生物学特性。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择2015年1月至2016年4月在我院眼科行眼眶减压手术的Graves’眼病患者12例，其中男7例，女5例；年龄23～67岁，平均48.6岁；病史2～6年，平均4.5年；活动期7例，非活动期5例。标本取自患者眼眶后部脂肪组织。本研究获我院医学伦理委员会同意，且所有患者术前均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 胎牛血清、DMEM/F-12(1 ∶1)培养液购自赛默飞世尔生物化学制品公司(生产批号分别为：NYB0814、NZE1150)，Ⅰ型胶原酶购自美国Sigma公司(生产批号：C0130)，苏丹Ⅲ购自上海研生公司(生产批号：20141126)，胰蛋白酶、青链霉素混合液、PBS溶液购自北京索莱宝生物公司(生产批号分别为：20141229、20150316、20150302)。

1.2.2 主要仪器 倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)，台式离心机(Hettich Mikro 120)，细胞培养箱(Shellab公司)。

1.3 方法

1.3.1 培养液的配制 培养液1：商品化的DMEM/F-12培养液；培养液2：取100 mL培养液1加入生物素、地塞米松、胰岛素使其终浓度分别为33 μmol/L、1 μmol/L、10 μg/mL；培养液3：取100 mL培养液1加入IBXM使其终浓度为0.25 mmol/L；以上培养液分装后于4℃冰箱保存备用，使用前添加双抗，即青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL。

1.3.2 消化液的配制 按说明称取Ⅰ型胶原酶150 mg、牛血清白蛋白2 g，加入0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)定溶至100 mL，调整pH值为7.2～7.4。

1.3.3 细胞培养

1.3.3.1 采用酶消化培养法进行细胞培养 术中取患者眼眶后部脂肪组织标本后，立即置入灭菌的玻璃培养皿中，用含青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 U/mL)的PBS溶液漂洗2次后，再用不含抗生素的PBS溶液清洗2次，随后分离、去除眼眶脂肪组织中肉眼可见的血管和纤维成分，用眼科剪剪成1 mm×1 mm小块，加入胶原酶，置于37℃、5%CO2培养箱内消化，15 h后取出培养皿，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液及漂浮的脂肪块，用培养液1把沉积的细胞制成混悬液，于六孔板中接种，种板密度为3×104/cm2，于37℃、5%CO2培养箱中孵育培养。16 h后取出培养板，以PBS轻轻洗掉未粘附细胞，更换为培养液3诱导、维持脂肪细胞分化，视细胞生长状况每3～4 d更换一次培养液2，使用倒置相差显微镜观察、记录脂肪细胞的生长状况，对多角形分枝细胞进行计数。

1.3.3.2 眼眶脂肪细胞的传代 当六孔板内脂肪细胞繁殖到基本融合时，吸干并弃掉旧的培养液，以PBS洗涤2次，加入适量胰蛋白酶进行消化，数分钟后倒置相差显微镜下观察发现脂肪细胞间隙增大，收缩呈近乎圆形，立即加入含血清培养液终止消化，轻轻吹打后1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量培养液2使细胞密度为2×104/cm2，置于37℃、5%CO2培养箱继续培养。视细胞生长状况每3～4 d更换一次培养液2，使用倒置相差显微镜观察、记录脂肪细胞的生长状况，对多角形分枝细胞进行计数。

1.3.3.3 多角形分枝细胞计数方法 对活动期和非活动期GO患者眼眶脂肪细胞均取3个孔板进行观察，随机选取9个高倍视野，按上、中、下、左、右、左上、左下、右上、右下的方位，对多角型分枝细胞予以计数统计。

1.3.4 苏丹Ⅲ染色 称取0.1 g苏丹Ⅲ，溶解于20 mL 95%酒精中配制成染液。将孔板中培养液吸干弃掉，PBS轻轻漂洗2次，自然干燥后加入75%酒精固定7 min，吸干酒精后加入适量苏丹Ⅲ染液，将孔板置于60℃烤箱中染色30 min，以浓度为50%的酒精进行分化，再以苏木素复染细胞核，于倒置相差显微镜下观察、记录细胞形态并拍照。

1.3.5 病理学检查 将术中取患者的眼眶脂肪组织标本置于含有固定液的标本瓶中，送至病理室做病理学检查。

1.4 统计学分析 采用SPSS 16.0统计学软件包进行统计分析，计量资料以 (x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GO患者眼眶脂肪细胞的形态、特征观察 脂肪细胞呈圆形，细胞贴壁后4 d，开始观察到多角形分枝细胞，第7～8天时开始增殖，多角形分枝细胞数目逐渐增多，2 d后该细胞变成椭圆形或近似圆形，约第15天时分化成单脂滴或多脂滴脂肪细胞。活动期和非活动期患者眼眶脂肪细胞中均发现一些多角形分枝细胞，在形态学上两组患者并没有差异。见图1、图2。

图1 活动期GO患者的眼眶脂肪细胞，可见多角形分枝细胞数目较多，胞体较大(×400)

图2 非活动期GO患者的眼眶脂肪细胞，多角形分枝细胞数目较少(×400)

活动期GO患者样本中多角形分枝细胞的数目明显多于非活动期GO患者，差异有统计学意义(t=19.337，P<0.001)。见表1。

表1 活动期及非活动期GO患者眼眶脂肪组织中 多角型分枝细胞数目的比较 (x±s)

2.2 GO患者眼眶脂肪细胞的苏丹Ⅲ染色结果 对GO患者眼眶脂肪细胞(梭形、多角型分枝细胞)进行苏丹Ⅲ染色后观察，发现细胞胞浆丰富，被染成红色的为胞体，不着色的为细胞分枝(图3)，已经分化成熟了的脂肪细胞则呈圆形，其胞膜较薄，胞浆丰富呈红色，苏丹Ⅲ染色可证明为脂肪成分，纤维成分不着色。

2.3 GO患者眼眶脂肪组织的病理学检查 于患者眼部手术中分离眼眶脂肪组织作病理学检查，患者情况：活动期7例，非活动期5例。检查结果提示，活动期患者眼眶脂肪组织中存在大量的淋巴细胞浸润，并有脂肪细胞扩张；而非活动期患者眼眶脂肪组织中无炎症细胞浸润，主要为脂肪细胞的扩张。见图4、图5。

图4 活动期GO患者脂肪细胞间隔中有大量淋巴细胞浸润，箭头所示，脂肪细胞扩张(×400)

图5 非活动期GO患者部分脂肪细胞明显扩张，脂肪细胞大小不一，但无淋巴细胞浸润(×400)

3 讨 论

脂肪组织是一种既具有炎性特征、又具有内分泌特征的组织，可分泌多种因子，如炎性因子、细胞因子等，在GO的发生发展中起到重要作用。近年来，眼眶脂肪细胞在GO发病机制的研究广受关注。

眼眶脂肪细胞的分化过程大致可分为四个阶段：多能干细胞、间质前体细胞、前脂肪细胞、成熟脂肪细胞。人体脂肪组织中的前脂肪细胞可分化为成熟脂肪细胞，并且保持着终身分化的能力，因此患者眼眶脂肪组织的增加不仅是脂肪细胞体积的增加，同时可伴有脂肪细胞数目上的增加。研究GO患者眼眶病变时，可考虑对眼眶脂肪细胞进行研究。我们通过应用组织培养法对人眼眶前脂肪细胞，即眼眶脂肪组织中的多角形分枝细胞进行培养诱导，已成功将其分化为成熟脂肪细胞[3]，发现活动期GO患者眼眶脂肪增生比非活动期患者更活跃，大量的淋巴细胞浸润，分泌多种细胞因子，促进眼眶脂肪细胞的数量增多和体积增大。研究表明，由几个转录因子协同调节脂肪细胞的分化，其中最主要的是CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP) 家族和核受体过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)γ蛋白家族的转录调控因子[4]。PPARγ、C/EBPα协同诱导脂肪细胞得以最终分化，同时脂肪组织自身分泌许多生物活性物质与其他一些调控脂肪细胞的分化的因子，如脂联素、瘦素等，在促进脂肪细胞增殖分化中起到重要的作用。Kim等[5]对Graves’病患者研究发现，合并有GO的患者其血清脂联素、瘦素水平明显高于没有GO的患者；临床活动性评分、眼部病情严重程度与血清脂联素、瘦素水平呈正相关。也有研究表明，透明质酸的过度产生也会导致脂肪细胞增殖[6]，在这些因子的共同作用下，刺激眶内免疫反应逐渐扩大，炎症病变加重，导致眼球突出、眶周水肿等一系列临床表现。

GO是一种自身免疫性疾病，根据GO的病程特点及临床表现，可分为活动期和非活动期(静止期)。GO活动期的症状和体征包括：角膜溃疡、眼球突出、结膜充血、水肿、复视、视神经受压导致的视力丧失。非活动期GO是指炎症消退并且有临床症状改善。本研究采用酶消化培养法对GO患者眼眶脂肪细胞进行培养，发现在GO活动期患者的眼眶脂肪组织中，存在大量的淋巴细胞浸润，而非活动期患者眼眶脂肪组织中无淋巴细胞浸润。在GO病变过程中，新的脂肪细胞生成、粘多糖聚集导致水肿，致使眼外肌、眼眶脂肪结缔组织扩张，从而引发一系列的临床表现。受累的组织中T淋巴细胞、B淋巴细胞弥漫浸润，少许巨噬细胞、促炎性细胞因子可见。这些细胞因子由浸润的单核细胞、眼眶脂肪细胞、巨噬细胞分泌，参与GO的炎症反应。GO活动期以Th1免疫反应为主，非活动期以Th2免疫反应为主。疾病的早期活动性阶段主要是多形核细胞和淋巴细胞浸润，而疾病慢性阶段主要是T淋巴细胞的浸润[7]。一些免疫抑制治疗方案广泛应用于GO的治疗，包括口服糖皮质激素、静脉注射糖皮质激素、球后注射糖皮质激素和眼眶放疗[8]；单独使用糖皮质激素进行免疫抑制治疗或联合放射治疗是GO活动期首选治疗方案，其治疗机制为杀伤对放射线敏感的淋巴细胞，减少细胞因子的分泌。而非活动期患者眼眶脂肪组织中无淋巴细胞浸润，这也是非活动期患者对放射治疗效果差的原因。

本研究结果显示，GO活动期患者脂肪细胞的形态与非活动期患者比较无明显差异，主要是在数量上的增多及大量的淋巴细胞浸润，新生的脂肪细胞可能与周围大量淋巴细胞和其它炎症因子的刺激有密切关系，这对GO的治疗具有一定的启示意义，即采用减少炎症细胞的产生、抑制细胞因子的活性的措施对促使GO活动期转变为非活动期有一定的帮助。

本研究虽然证实了GO活动期存在大量淋巴细胞，但是眼眶脂肪细胞的具体增殖分化机制仍未明确。这有待于今后建立GO疾病模型对其进行深入了解。

[1] Boboridis KG, Bunce C.Surgical orbital decompression for thyroid eye disease[J].Cochrane database Syst Rev,2011(12):CD007630.

[2] Tieghi R, Consorti G, Franco F, et al.Endocrine orbitopathy (Graves disease): transpalpebral fat decompression in combination with 3-wall bony expansion[J].J Craniofac Surg,2010,21(4):1199-1201.

[3] 蒋本丽,李凯军,何剑峰,等.眼眶前脂肪细胞的培养及其对Graves眼病的意义[J].内科,2012,7(2):107-110.

[4] Lucas RM, Ponsonby AL, Dear K, et al.Sun exposure and vitamin D are independent risk factors for CNS demyelination[J].Neurology,2011,76(6):540-548.

[5] Kim BY, Mok JO, Kang SK, et al.The relationship between serum adipocytokines and Graves’ ophthalmopathy: A hospital-based study[J].Endocr,2016,63(5):425-430.

[6] Zhang L, Grennan-Jones F, Lane C, et al.Adipose tissue depot-specific differences in the regulation of hyaluronan production of relevance to Graves’ orbitopathy[J].J clin Endocrinol Metab,2012,97(2):653-662.

[7] Avunduk AM, Avunduk MC, Pazarli H, et al.Immunohistochemical analysis of orbital connective tissue specimens of patients with active Graves ophthalmopathy[J].Curr Eye Res,2005,30(8):631-638.

[8] Mou P, Jiang LH, Zhang Y, et al.Common Immunosuppressive Monotherapy for Graves’ Ophthalmopathy: A Meta-Analysis[J].PloS One,2015,10(10):e0139544.

Study of morphology in orbital adipose of Graves’ ophthalmopathy patients

YEYuan，HEJianfeng，LIKaijun

(DepartmentofOphthalmology，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To observe the biological characteristics of orbital adipose cells in Graves’ ophthalmopathy patients. Methods Twelve Graves’ ophthalmopathy patients undergoing orbital decompression surgery were selected as the object of observation, orbital adipose tissues specimens were obtained in the course of surgery.Those adipose tissues were cultured in vitro by enzymatic digestion culture method，maked Sudan III staining and pathological examination.Observed the morphological features of adipose cells from active phase and inactive phase patients. Results During the in vitro cultivation of adipose tissues,The orbit branch polygon cells were induced into mature adipose cells. The number of branch polygon cells in active patients were significantly more than inactive patients, the difference was statistically significant between the two groups(P<0.05). There was a large number of lymphocytes infiltrated in the orbital adipose tissue of active patients，this kind of situation did not appear on inactive patients. Conclusion The adipose tissue hyperplasia in active period were more active than those in inactive period.

Graves’ ophthalmopathy; Orbital adipose cells;Orbit; Lymphocytes; Extraocular muscles;Morphology

国家自然科学基金(编号：81360152)

叶园(1990～)，女，在读硕士研究生，研究方向：视神经炎及内分泌眼病。

R 777.5

A

1673-6575(2016)06-0815-04

10.11864/j.issn.1673.2016.06.01

2016-08-15

2016-10-12)

*通信作者