低分子量聚谷氨酸的制备及其在眼科靶向药物中的应用研究

陈 卓，石 蕊，谭李玉，邬莉娜，毕群杰，夏 锐，张 蕾

（1. 西安医学院 陕西 西安 710021； 2. 陕西省人民医院眼科，陕西 西安 710068）

低分子量聚谷氨酸的制备及其在眼科靶向药物中的应用研究

陈 卓1，石 蕊2，谭李玉1，邬莉娜1，毕群杰1，夏 锐1，张 蕾1

（1. 西安医学院 陕西 西安 710021； 2. 陕西省人民医院眼科，陕西 西安 710068）

人体角膜难以吸收分子量较大的药物分子，为了减少高毒药物治疗眼表疾病时经角膜吸收导致的眼内副作用，设计了丝裂霉素C的L-聚谷氨酸衍生物高分子前药。为了减少市售链状大分子聚谷氨酸修饰后，丝裂霉素C被其包缠导致的药效降低，将市售的L-聚谷氨酸先进行定量水解，获得了一系列较低分子量的L-聚谷氨酸（1～5 k），通过电泳法确证其分子量，并将其应用制备了系列低分子量L-聚谷氨酸衍生物高分子丝裂霉素C前药。

低分子量聚谷氨酸；前药；高分子修饰；丝裂霉素C

聚谷氨酸(polyglutamic acid, PGA)是以枯草芽孢杆菌通过发酵技术制备的一种高分子化合物[1]。PGA以其低毒性和免疫原性、高降解性、不易蓄积性在药学领域有着广泛应用。被广泛应用于缓控释以及靶向药物的载体[2]。市售的聚谷氨酸的分子量通常在300～1 000 kDa之间， 陈国广等报道了分子量在20～60 kDa之间低聚谷氨酸的制备工艺[3]。

人眼如长期受到外界剌激，如日光、风沙、雾霾等，常易在睑裂部球结膜引起赘生性病变。首先，赘生生长浸润角膜可导致角膜曲率改变而引起不同程度的散光、眼球转动障碍、视力下降，严重影响了病人的生活质量；其次，赘生组织本身也易引发反复发生的眼红、磨不适，导致结膜炎反复发生及由此产生的长期治疗费用；第三，赘生的生长严重影响了病人的眼部外观。

在临床治疗时，多采用手术切除法，但单纯术后极易复发，其术后高复发率是一个十分棘手的问题，复发原因与手术创伤加快了成纤维细胞增生有关，复发通常发生于术后短期时间内，复发组织进展快，常较原发者扩大。因此，在治疗中必须在术中、术后联用丝裂霉素C(Mitomycin C , MMC)等高毒性抗代谢药物[4]。目前没有其他替代方案。当这些高毒药物眼表施用后极易通过角膜吸收进入眼球内，导致眼内组织如晶状体、玻璃体及视网膜等受损[4]。因此，此类药物的靶点位于眼表，但其眼内副作用则由角膜吸收所导致。

角膜是保护眼内组织的重要屏障，其屏障作用主要通过分子量限制、极性限制和P蛋白外排作用来实现，其中，分子量限制使分子量达到500以上的化合物难以通过角膜吸收[5]。本课题组将丝裂霉素C与PGA等高分子化合物[6]通过化学合成的方法制备为高分子前药，以减少其角膜吸收，从而使其在翼状胬肉等结膜、眼表疾病的应用中，降低了全眼副作用。

PGA是多羧基聚合物，其链上的羧基使其具有pH响应性，在低pH值环境下，呈直链状；在眼部的生理pH值7.35～7.45下则呈卷曲状。这时，无论市售的300～1 000 kDa的超聚谷氨酸或20～60 kDa的低聚谷氨酸的修饰的丝裂霉素C将被包缠、遮盖、空间位阻大，难以被酯酶水解释放活性代谢物物质丝裂霉素C。因此，用于制备眼表靶向前药的PGA的适宜分子量应当仅略大于使药物难以进入角膜的500 Da，从而减少对药物本体的包缠遮蔽。目前，适宜于眼表疾病药物研究的1至5 kDa之间的低聚谷氨酸及其前药制备应用研究未见文献报道。

1 仪器与试剂

紫外分光光度计为UV-1780型（日本岛津制作所）；冷冻干燥机为FD-1000型（日本东京理化株式会社）；磁力搅拌低温槽为PSL-1810型（日本东京理化株式会社）；电泳仪为DYCP-31DN型（北京六一）。

丝裂霉素 C 为化学纯(Sigma-Aldrich)；PGA(300～1 000 kDa) 为化学纯(Sigma-Aldrich)；Tris试剂(Sigma-Aldrich),琼脂糖(Sigma-Aldrich)吡啶为分析纯（天津科密欧）；1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亚胺盐酸盐（EDC）为分析纯（上海源叶生物科技）；N-羟基琥珀酰亚胺为分析纯（上海源叶生物科技）；水为双蒸水；透析袋（MWCO 1000及MWCO 5000, 百灵威科技）;柱层析所使用薄层硅胶为硅胶H（青岛海洋化工）;其他常见有机溶剂、试剂均为分析纯，必要时干燥。

2 低分子量聚谷氨酸的制备研究

2.1 低分子量聚谷氨酸的制备

取聚谷氨酸（分子量300～1 000 kDa）20 g，溶于以盐酸调节至～H=1-7的水中，在-10～80 ℃下搅拌8 h；反应结束后，将反应液使用透析袋进行分离，截取分子量1 000～5 000的聚谷氨酸，冷冻干燥得到白色固体即为低分子量聚谷氨酸。

2.2 低聚谷氨酸的制备工艺研究

2.2.1 产物的纯化研究

透析袋是一种成熟市售的基于渗透压分子量截留原理对溶液中一定分子量的化合物进行分离的产品。

由于需要1至5 kDa的聚谷氨酸，我们采用双层透析层的装置进行分离。取直径29 mm的截留分子量1 000的透析袋作为外层，其中置入直径11 mm的截留分子量5 000的透析袋为外层。将反应液加入内袋中，密封上口，将此装置置于盛有800 mL蒸馏水的烧杯中，室温搅拌4 d，期间每8 h更换烧杯中蒸馏水一次。透析结束后将内袋提出弃去后，将外袋中液体冷冻干燥即得白色固体聚谷氨酸(分子量1至5 kDa)。采用电泳法测定、验证产物的分子量。

2.2.3低聚谷氨酸的制备工艺考察

由于在产物纯化中已将未水解至目标分子量的产物及副产物除去，因此通过考察反应的质量收率即可反映制备工艺情况。考察了反应液pH值，温度两项指标。

从表1及图1中 可以看出，最佳水解条件为pH=3，温度为60 ℃，在这一条件下可以获得10.1%的收率。

表1 pH对目标分子量低聚谷氨酸制备收率的影响（温度均为室温，约20 ℃）Table 1 Effect of pH to the yield of low molecular weight PGA

图1 pH对目标分子量低聚谷氨酸制备收率的影响Fig.1 Effect of pH to the yield of low molecular weight PGA

3 低分子量聚谷氨酸-丝裂霉素C的制备

将低分子量聚谷氨酸1 g加入单口瓶中，加入二氧六环250 mL、N-羟基琥珀酰亚胺0.61 g、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亚胺盐酸盐（EDC）1.03 g和吡啶3 mL，在50 ℃下保温10 h，蒸去溶剂，剩余物溶于100氯仿，用稀盐酸10 mL洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.03 mol/L HBS缓冲液（pH为7.4）10 mL中，搅拌下加入丝裂霉素C 3.34 g，期间加入 0.5 mol/L 氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持pH=7.4；然后搅拌12 h反应液后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离（洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10∶1组成的混合物）得黄色至白色产物，即低分子量 L-聚谷氨酸-丝裂霉素 C（图2）。

图2 低分子量聚谷氨酸-丝裂霉素C的制备Fig.2 Preparation of low molecular weight PGA-MMC

4 讨 论

本研究发现，在制备低分子量聚谷氨酸的水解过程中，酸性有利于水解反应的继续进行。但当pH下降至1时，收率反而下降。这可能是因为我们的目标分子是1至5 kDa的聚谷氨酸，当酸性提高时，水解反应的速率过快，更多的聚谷氨酸分子被水解至1 kDa分子量以下的小分子，从而在透析中被透析至外层膜以外除去，使目标化合物的收率下降。

抗癌药物的一个发展方向是聚合物治疗法。聚合物-药物偶合物是指将适当的聚合物载体、生物可降解的交联剂和具有生物学活性的抗肿瘤药物结合起来，这一设计思路备受人们关注，并且将很有可能成为新一代抗肿瘤药物设计的基础。

因此，本研究所获得的低分子量聚谷氨酸可以应用在丝裂霉素 C进行修饰，使其可以通过 EPR effect在增生组织中积聚，然后由cathepsin B介导丝裂霉素C的释放，从而达到治疗作用。而在正常组织中，由于其分子量较大，难以透过角膜进入眼内，从而大幅降低其经角膜通路的眼内吸收，使其在眼表赘生组织治疗的应用中，提高药效、降低全眼副作用。

［1］ Atsuo , Masao K. Biosynthesis and hydrolysis of poly (γ-glutami c acid)from Baci llus subtilis IFO3335 [J]. Biosci Biotech Biochem ,1992, 56(7):1031-1035.

［2］ 陈国广，陈茂伟，韦萍，等．聚谷氨酸及其衍生物在新型药物传输系统中的应用[J]. 南京工业大学学报(自然科学版)，2003 , 25(2): 75-78.

［3］ 陈国广, 张钧寿, 陈茂伟，等．低分子聚谷氨酸的制备工艺研究[J]. 中国药科大学学报，2003 , 34(3): 225-227．

［4］ Rachmiel R, Leiba H, Levartovsky S. Results of treatment with topical mitomycin C 0.02% following excision of primary pterygium[J]. Br J Ophthalmol,1995, 79(3): 233-236.

［5］ 严忠勤, 钟裕国, 温玉明. 趋淋巴抗癌药丝裂霉素-右旋糖酐偶联物的合成及生物学性质的研究[J]. 中国药物化学杂志, 1999, 4(9): 240-244.

［6］ 陈卓，石蕊，谭李玉，等．聚乙二醇单甲醚偶联的丝裂霉素C前药的合成[J]. 应用化工，2015，44(10)：1971-1972．

钛精矿狂涨钛白粉伤不起 产业链要互利

近期钛精矿价格上涨显著，又遭攀枝花地区环保曝光。目前攀西地区38品位以上钛中矿价格在800-850元/吨(不含税)左右，46品位10钛精矿价格在1250-1400元/吨(不含税)间，47品位钛精矿价格在1100-1200元/吨(不含税)间。进口钛矿价格新单成交价同样走高。进入10月后至今，钛精矿价格狂涨以及运输新规实施带来的运费增加，使钛白粉涨“停不下来”更“伤不起”。

以攀枝花钛矿为例，自2013年年初的1500元/吨左右跌至年底的500元/吨，同期2013年上半年金红石型钛白粉市场均价约为14500元/左右，2013年年底大约均价为14000元/吨，钛矿跌价幅度与钛白粉价格跌幅不成正比。

2015年国内钛矿基本维持在400-600元/吨之间，可金红石型钛白粉市场价格从年初的12500元/吨飞流直下跌破9000元/吨，钛白粉跌幅与钛矿价格不成比例。

2015年金红石型钛白粉跌破9000元/吨的情况下，涂料企业普遍“盆丰钵满”，据有关数据统计显示，2015年我国涂料行业平均利润实现8%-10%的增长。

产业链是产业价值实现和增值的根本途径。我们从以上数据或可以“略见一斑”，在紧密相关的产业链上，违背了市场规律，产业链将会断裂，如今已经不存在暴利时代，暴涨暴跌的年代已经过去，产业链中暴涨暴跌一个环节，或造成“链断”伤不起。

新常态下，企业转型升级是必由之路。钛白粉产业结构调整和转型升级的大环境下把握机遇、顺势而为，提升产品质量达国际先进水平，为下游企业提供“性价比”优质的产品是发展的前提，产业链互利是产业良性发展的基础，在互利中企业才能获得最大效益。

Preparation of Low Molecular Weight Polyglutamic Acid and Its Application in Targeting Ophthalmic Prodrug

CHEN Zhuo1, SHI Rui2, TAN Li-yu1, WU Li-na1, BI Qun-jie1, XIA Rui1, ZHANG Lei1

（1. Xi’an Medical University , Shaanxi Xi’an 710021, China；2. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Shaanxi Xi’an 710068, China）

Large molecular weight drugs cannot be absorbed by human corneas. In order to minimize the side effects caused by absorption into eyeball trough cornea in the application of the highly toxic Mitomycin C in ocular surface diseases, PGA derivative macromolecule prodrug PGA-MMC was designed. To reduce the package wrapping effect on MMC using the chain-like macromolecules modifying such as PGA, which can make the pesticide effect reduce, PGA was first quantitative hydrolyzed to get lower molecular weight PGA（1~5 k）.And then series of low molecular weight PGA-MMC was synthesized .

PGA with lower molecular weight; prodrug; macromolecules modifying; mitomycin C

R9; TQ463

A

1671-0460（2016）12-2787-03

陕西省教育厅专项科研计划项目，项目号：15JK1620。

2016-11-28

陈卓（1985-），男，陕西西安人，讲师，硕士，研究方向：从事药物化学研究工作。E-mail：352304625@qq.com。