响应曲面法优化Gluconobacter melanlgenu X42培养基

陈羽，徐威，位星，胡思宇

(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016)

响应曲面法优化Gluconobacter melanlgenu X42培养基

陈羽，徐威*，位星，胡思宇

(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016)

采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和中心组合试验相结合的策略对Gluconobacter melanlgenu X42转化培养基进行优化。试验结果表明:最佳转化培养基组成为麦芽抽提物0.46 g/L、蛋白胨2.07 g/L、CaCO30.70 g/L、ZnSO40.04 g/L。优化后L-山梨糖生成量提高了9.9%。可以应用响应曲面法对G.melanlgenu X42转化培养基进行优化。

生黑葡萄糖酸杆菌;培养基;响应曲面法;L-山梨糖;条件优化

维生素C是一种水溶性维生素，能够参与体内多种羟基化反应和氧化还原反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物［1］。我国发明的维生素C“二步发酵法”是经生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter melanlgenu)转化D-山梨醇为L-山梨糖，再经过细菌发酵生成维生素C前体2-酮基-L-古龙酸［2］。响应曲面法(Response Surface Methodology)是一种通过合理的实验设计来收集数据，应用曲面模型及各影响因素的二次多项式来评估反应变量变化规律的设计方法。因其能恰当地利用实验设计所收集的数据，有效地评估模型中的参数，受到国内外各科学领域的广泛关注［3-4］。本研究采用响应曲面法对所构建的基因工程菌G.melanlgenu X42(pUC 19-vgb)的转化培养基进行优化，以期为企业在大规模生产中节约能耗、降低生产成本提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种G.melanlgenu X42(pUC 19-vgb)由本课题组保藏。

1.1.2 培养基(g/L)种子培养基:山梨醇160，麦芽提取物5，CaCO32.50;转化培养基:山梨醇230，蛋白胨2，麦芽提取物0.40，CaCO30.70，ZnSO40.04。

1.2 方法

1.2.1 L-山梨糖含量的测定L-山梨糖含量的测定参见文献［5］。

1.2.2 Plackett-Burman试验设计保持D-山梨醇含量不变，采用Plackett-Burman(PB)试验对麦芽抽提物(X1)、蛋白胨(X2)、CaCO3(X3)和ZnSO4(X4)进行考察。每个因子取2个水平，高水平编码为+1，低水平编码为－1，筛选对L-山梨糖产量影响显著的因素，各因子水平取值见表1。

表1 试验因子和水平设计Table 1Design of experimental factors and levels

1.2.3 最陡爬坡试验设计以PB设计挑选出对响应值影响显著的因素设计最陡爬坡试验，确定爬坡方向和变化步长。

1.2.4 中心复合设计和响应面分析试验基于PB试验和最陡爬坡试验结果，采用响应面分析寻求最佳培养基优化条件。

1.2.5 响应面模型验证按照模型预测的最佳组分配比制备培养基，连续进行5批摇瓶转化试验，验证模型的有效性。

2 结果与分析

2.1 Placket-Burmen试验

以L-山梨糖生成量Y作为响应值，进行PB试验设计，试验结果见表2。对表2中的PB设计结果进行线性回归拟合(表3)，可得到一次回归方程Y=221.83+2.67X1+2.92X2+1.00X3－1.08X4。方程决定系数R2为91.17%，表明该回归方程拟合良好。由表3中的P值可知，麦芽抽提物和蛋白胨是影响L-山梨糖生成量最显著的因素。

表2 Plackett-Burmen设计试验结果Table 2Experimental result of Plackett-Burmen design

表3 Plackett-Burman设计回归分析Table 3Regression analysis of Plackett-Burmen design

2.2 最陡爬坡试验

其他因素保持原始水平不变，对X1、X2两个显著因素进行最陡爬坡试验。由表4可知，最优条件在4组附近，故以其为后续响应曲面试验的中心点。

表4 最陡爬坡试验结果Table 4Experimental results of slope-climbing test

2.3 中心复合试验设计和响应面分析试验

其他因素保持原始水平不变，根据最陡爬坡试验得到的中心点，X1、X2进行中心组合试验设计(表5)。中心组合试验结果见表6。对表6中的试验结果进行回归拟合(表7)，得到一个二元二次方程:Y=237.00+2.08X1－2.02X2+3.25X1X2－6.66X12－5.78X2

2。方程决定系数R2为98.34%，表明方程拟合较好。

表5 中心组合试验变量及水平Table 5Variables and levels of central composite test

表6 中心组合试验结果Table 6Experimental results of central composite test

表7 中心组合试验回归分析Table 7Regression analysis of central composite test

将响应值进行拟合后得到响应曲面图见图1。利用Design Expert 8.0软件可以得到模型极值，X1=0.46 g/L，X2=2.07 g/L。保持其他因素不变，预测L-山梨糖最大生成量为237.3 g/L。

2.4 响应面模型验证

按照模型预测的最佳组分配比制备培养基，连续进行5批摇瓶转化试验，验证模型的有效性，试验结果见表8。由表8可以看出，优化培养基L-山梨糖生成量平均值为237.5 g/L，比初始培养基L-山梨糖生成量(平均值为216.2 g/L)提高了9.9%，展示出优化培养基的优越性。

表8 验证实验结果Table 8The result of the validation experiment

图1 麦芽抽提物与蛋白胨的交互响应曲面Fig.1Response surface stereogram for malt extract and peptone

3 讨论

G.melanlgenu在转化D-山梨醇的过程中，山梨醇较黏稠，严重影响氧气的传递速度。因此，在维生素C发酵生产的过程中，氧传递速度是一个生产瓶颈，供氧己成为提高产品产量的主要限制因素之一。

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)是一种具有氧结合与传递能力，能在极低的溶氧水平下被大量诱导合成的血红蛋白。自被发现以来便引起各国科学家的广泛关注，其研究也为解决供氧问题提供了一个新的思路［6-8］。我们借助基因工程技术，实现了透明颤菌血红蛋白基因在G.melanlgenu中的克隆与表达。通过前期的单因素考察试验，发现转化培养基中蛋白胨、麦芽提取物、CaCO3和ZnSO4对G.melanlgenu X42转化D-山梨醇影响显著。本研究采用响应曲面设计中的中心复合设计，建立了优化G.melanlgenu X42转化培养基组分的二次多项数学模型，利用模型的响应面对转化培养基各组分进行探讨，确定了培养基组分的最佳水平范围，优化出转化培养基中各种成分的浓度为麦芽抽提物浓度0.46 g/L，蛋白胨浓度2.07 g/L，CaCO3浓度0.70 g/L，ZnSO4浓度0.04 g/L。采用摇瓶转化试验验证模型的有效性，结果显示，与初始转化培养基相比，优化培养基L-山梨糖生成量提高了9.9%，展示出响应曲面法优化培养基的优越性。

传统的培养基优化一般采用单因素试验方法，但单因素试验不能考察到因素间的相互作用。PB设计能快速准确地从影响L-山梨糖生成量的众多因素中筛选出最重要的影响因素，并能为爬坡试验指出方向和变化步长，接近最大产量区域。之后根据爬坡试验得到的中心点进行中心组合试验，并运用响应面分析方法，回归拟合中心组合试验数据，得到能与实际情况拟合良好的模型方程，进而确定最适的培养基组成［9-10］。

［1］Yang L，Lei C，Lin F，et al.Effect of Vitamin C on proliferation and differentiation of intestinal epithelial cells of Jian carp［J］.Progress in Veterinary Medicine，2012，33(8):41-46.

［2］宫晓丽，郭智勇，吕淑霞，等.巨大芽孢杆菌B.m2980产孢对氧化葡萄糖酸杆菌产酸的影响［J］.工业微生物，2013，43 (6):49-53.

［3］宋浩，纪兆林，陈夕军，等.地衣芽孢杆菌W10菌株发酵培养基优化［J］.扬州大学学报，2015，36(1):87-91.

［4］Zamberi MM，Ani FN，Hassan SN.Optimization of biodiesel production from transesterification of waste cooking oils using alkaline catalysts［J］.Applied Mechanics and Materials，2014，695:289-292.

［5］Xu S，Wang XB，Du GC，et al.Enhanced production of L-sorbose from D-sorbitol by improving the mRNA abundance of sorbitol dehydrogenase in Gluconobacter oxydans WSH-003［J］Microbial Cell Factories，2014，13(1):146-153.

［6］徐威.丝状真菌高效稳定转化体系的建立和透明颤菌血红蛋白基因的克隆表达研究［D］.沈阳:沈阳药科大学，2004.

［7］黄钦耿，吴伟斌，翁雪清，等.VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的表达及其抗贫氧效率［J］.氨基酸和生物资源，2012，34(2):9-12.

［8］Wu JM，Fu WC.Intracellular co-expression of Vitreoscilla hemoglobin enhances cell performance and β-galactosidase production in Pichia pastoris［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113(3):332-337.

［9］刘坤，郭威，胡雪芹，等.响应曲面法优化苏云金芽孢杆菌B28培养基［J］.安徽农业科学，2011，39(16):9690-9694.

［10］潘淑勇.响应曲面法优化柔红霉素发酵培养基［J］.中国抗生素杂志，2012，37(11):830-836.

Gluconobacter melanogenus X42 Medium Optimized by Response Curved Surface Methodology

CHEN Yu，XU Wei，WEI Xing，HU Si-yu
(Schl.of Life Sci.＆Biopharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang 110016)

The transformation medium of Gluconobacter melanogenus X42 was optimized with the tactics of Plackett-Burman design，slope-climbing test and central combination test.The experimental results showed that the optimum transformation medium components were:malt extract 0.46 g/L，peptone 2.07 g/L，CaCO30.70 g/L and ZnSO40.04 g/L.L-sorbose production was increased by 9.9%after the optimization.G.melanogenus X42 transformation medium could be optimized by the response curved surface methodology.

Gluconobacter melanogenus;medium;response curved surface methodology;L-sorbose;conditions optimization

Q815

A

1005－7021(2016)04－0067－04

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.012

辽宁省教育厅一般项目(L2013380);辽宁省教育厅高等学校创新团队项目(LT2014023)

陈羽男，讲师，硕士。主要从事微生物转化及基因工程菌改造研究。E-mail:gzweishengwu@126.com

*通讯作者。女，教授，博士，硕士生导师。主要从事微生物制药及微生物转化合成生物活性物质的研究。

E-mail:shxuwei8720@163.com

2015-11-16;

2016-01-20