表面接枝不同分子量聚乙二醇的聚氨酯材料的抗粘附性能研究

许德秋，关雅元，刘 畅，蒋雨辰，张吉亚，罗建斌

(西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041)

表面接枝不同分子量聚乙二醇的聚氨酯材料的抗粘附性能研究

许德秋，关雅元，刘 畅，蒋雨辰，张吉亚，罗建斌

(西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041)

通过利用聚多巴胺与氨基基团的共价反应，将不同分子量的氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH2)固定于聚氨酯(PU)材料表面，并系统地研究了不同分子量聚乙二醇修饰的聚氨酯材料表面的抗粘附性能.实验中采用了三种不同分子量的氨基聚乙二醇单甲醚，分别是分子量1 000、2 000和5 000.对修饰后的材料表面进行的X射线光电子能谱测试及静态接触角测试证实了不同分子量的聚乙二醇成功地接枝于聚氨酯材料表面.通过对材料表面在不同时间段抗金黄色葡萄球菌粘附效果的分析，以及抗血小板粘附测试，系统地探讨了聚乙二醇分子量的不同对所修饰材料表面抗粘附效果的影响.并针对由分子量2 000与5 000的聚乙二醇修饰的材料表面进行了抗细菌生物膜测试.

聚乙二醇；抗粘附；聚多巴胺；聚氨酯

在自然环境中，各种微生物的生长与物质表面息息相关.附着在材料表面的微生物常常聚集生长，并相互联结产生细胞外聚合物，从而形成细菌生物膜.在生物环境中，细菌生物膜中的细菌对于抗菌药物有着更强的抵抗能力，使得其常常引发各种健康问题，造成经济损失[1-3].当细菌粘附在医用植入器材中，并随后生长为细菌生物膜，则易引发与植入器材相关的人体感染，通常需要通过手术将器材取出[4-5].在食品工业中，细菌生物膜一旦形成于设备器材表面，则易引发相关食品的交叉污染，造成食品质量下降，甚至造成食源性疾病的传播等更为严重的食品安全问题[6-8].

目前有关研究已经证实，将一些材料表面涂覆亲水性的聚合物层可以有效地减少蛋白质、细胞以及细菌等的粘附[9-12].在这一领域的多数研究都涉及聚乙二醇(PEG)或其衍生物的使用[13-19].聚乙二醇是一种以-CH2CH2O-为重复结构单元，且聚合物链的两端以羟基基团封端的高分子.对由聚乙二醇修饰的材料表面对于蛋白质及细胞的排斥机理尚未确定，目前已被证实可用于解释其抗粘附特性的因素有以下几个方面，包括聚乙二醇的亲水性、分子链的高活动性、排斥体积大以及空间位阻效应[19-21].由聚乙二醇修饰的材料表面在抗蛋白质粘附方面已被广泛地研究，也取得了较好的效果[10，15-17].从理论上讲，聚乙二醇的分子量(链长度)可能是影响其接枝密度、氢键供/受体数量以及聚乙二醇其他特性的因素之一[22].不少研究者已证实，聚乙二醇分子链的长度越长其排斥性越好[15，23-24].如Benhabbour等人的研究结果显示[23]，由聚乙二醇单甲醚(PEG-OMe)共价连接后的镀金硅片表面抗蛋白粘附性能与其分子量大小相关.又如Zhu等人的研究结果显示[24]，聚乙二醇接枝表面抗3T3细胞粘附的效果与其分子量有关.这些研究结果表明聚乙二醇的分子量在其抗蛋白及细胞粘附方面扮演着重要角色.

在过去的数年中，越来越多的研究者开始关注聚乙二醇涂层在抗细菌粘附方面的作用[14，18，25-27].然而，由各种聚乙二醇修饰的材料表面的抗细菌粘附效果大相径庭，有些甚至没有效果，而有些却能达到降低几个数量级的作用[28].这些效果的差异可以归因于聚乙二醇接枝方法的不同、实验条件的不同以及细菌种类的不同，因此不易将不同研究组所得的实验结果进行对比.此外，很少有关于不同分子量的聚乙二醇在抗细菌粘附方面影响的研究，其结果也不太一致.例如，Park等人的研究结果显示[18]，聚氨酯表面接枝的聚乙二醇链越长，其抗表皮葡萄球菌和大肠杆菌粘附的效果越好.然而Cunliffe等人却证实了聚环氧乙烷单甲醚MeO-PEO-5000与MeO-PEO-3000在抗单核细胞增多性李斯特氏菌粘附方面具有相同效果[29].

细菌长时间粘附在材料表面后，可进一步生长为细菌生物膜.就目前所知，很少有关于不同分子量的聚乙二醇在抗细菌生物膜方面影响的研究报告.本文设计了一种简单易行的方案，通过多巴胺在碱性溶液中发生氧化自聚合，在聚氨酯材料表面形成具有超强黏性的聚多巴胺涂层，使其作为二级反应平台进一步引入了末端由氨基修饰的聚乙二醇单甲醚(mPEGNH2)[30]，得到了表面接枝不同分子量聚乙二醇的聚氨酯材料.本研究的目的在于系统地研究由不同分子量聚乙二醇修饰的聚氨酯材料表面在不同时间段的抗细菌粘附效果差异，同时进一步探讨其抗细菌生物膜的效果，又通过对比不同分子量聚乙二醇修饰表面的抗血小板粘附性能来分析其血液相容性差异.本实验中采用的细菌菌种为金黄色葡萄球菌ATCC 6538.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

表1 原料与试剂Table 1 Raw materials and reagents

1.2 实验过程

1.2.1 聚氨酯基材的准备

以聚丁二醇(PTMG1000)、二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)和1，4-丁二醇(BDO)为原料，通过本体法合成适量聚氨酯(PU)，溶解于四氢呋喃(THF)后倒入聚四氟乙烯表面皿中成膜.将干燥成的聚氨酯薄膜剪切为10 mm×10 mm大小的膜片，厚约1 mm.分别使用蒸馏水和无水乙醇超声清洗，并用氮气吹干后保存.

1.2.2 聚氨酯材料的表面修饰

如图1显示的实验流程.将准备好的聚氨酯膜片(PU)浸入多巴胺浓度为2 mg/mL的10 mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液，溶液的pH为8.5，于室温下反应24小时后便得到涂覆了聚多巴胺层的聚氨酯膜片(PU-DA).配置三种相同浓度的不同分子量氨基聚乙二醇单甲醚溶液，且同样是pH为8.5的10 mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液，随后将PU-DA膜片分别浸入三种溶液中，于55℃下反应隔夜，即得到表面分别接枝不同分子量聚乙二醇单甲醚的聚氨酯膜片(PU-DA-PEG1000，PU-DA-PEG2000及PU-DA-PEG5000).

图1 实验操作流程图Fig.1 Polymer coating process

1.2.3 材料表面的表征

(1)静态接触角测试:选用溶剂去离子水，每个样品测试三个点，取平均值；测试在室温下进行，相对湿度65%.接触角测试仪型号:JC2000D1(POWEREACH公司，上海).

(2)X射线光电子能谱测试:测试角度为90°，使用Al Kα X射线源.仪器型号:ESCALAB 250 Xi (Thermo Scientific公司，美国).

1.2.4 抗菌测试

本文中的抗菌实验选用金黄色葡萄球菌进行抗菌测试，通过菌落计数法测试材料表面抗细菌粘附能力，并测试了相关样品的抗细菌生物膜能力.

1.2.4.1 准备工作

(1)制备液体培养基与平板培养基:将胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)与胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)分别按比例溶解于适量去离子水中，配置为溶液后分别装于锥形瓶中，用无菌培养容器封口膜密封后，在120℃下高压蒸汽灭菌30 min.将灭菌后未凝固的胰酪胨大豆琼脂培养基趁热定量倒入灭菌过的培养皿中，水平放置于紫外灯下，冷凝固化.

(2)准备无菌生理盐水:配置500 mL生理盐水(含氯化钠0.9%)，分装于锥形瓶后，用无菌培养容器封口膜密封后，于120℃下高压蒸汽灭菌30 min.

(3)制备细菌悬浮液:用灭菌后的接种环从平板菌种上取适量清晰的单一菌落接种到灭过菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，于37℃水浴摇床中震荡培养16小时，确定细菌悬浮液浓度约为108CFU/mL.

1.2.4.2 细菌粘附实验

本实验通过菌落计数法来测试材料表面抗细菌粘附的能力.菌落计数法是将细菌悬浮液按照一定的浓度梯度稀释，分别取不同浓度的稀释菌液涂板于固体培养基中，培养后选择菌落数清晰且小于300个可见菌落的平板进行计数，从而定量得出细菌悬浮液浓度.

实验时，用消毒酒精清洁待测的聚氨酯膜片表面后，分别放入48孔板内，置于紫外灯下灭菌1 h.向各孔中分别加入1 mL浓度为105CFU/mL的细菌悬浮液，放入恒温培养箱中，于37℃下分别培养16 h，24 h及48 h.之后用无菌生理盐水冲洗膜片三次，除去膜片表面未牢固粘附的细菌.再将膜片分别放入含2 mL无菌生理盐水的PE管中，超声8 s使膜片上粘附的细菌进入溶液，旋涡混合均匀后使用菌落计数法对该细菌悬浮液进行计数，分析其细菌浓度.

1.2.4.3 抗细菌生物膜测试(SEM)

同样地，用消毒酒精清洁待测的聚氨酯膜片表面后，分别水平放入24孔板内，置于紫外灯下灭菌1 h.向各膜片上分别滴加100 μL浓度为105CFU/mL的细菌悬浮液，使膜片被菌液所覆盖，放入恒温培养箱中于37℃下培养，每日补加20 μL同样的菌液.培养7天后，用无菌生理盐水冲洗膜片三次，除去膜片表面未牢固粘附的细菌.将冲洗后的膜片分别置于48孔板内，向各孔分别加入1 mL 2.5%的戊二醛水溶液，于4℃下固定处理4 h.之后除去戊二醛溶液，依次使用25%、50%、75%、95%、100%的乙醇溶液对膜片表面进行梯度脱水处理10 min.真空干燥后喷铂金，使用扫描电子显微镜观察样品表面的细菌生物膜生长情况(仪器型号:INSPECT F，FEI公司，美国).

1.2.5 血小板粘附测试(SEM)

取新鲜的兔血于1500 rpm/min离心10 min以得到富含血小板的血浆(PRP).将待测样品浸入该血浆，放入恒温箱中于37℃下静置30 min.用无菌PBS缓冲溶液冲洗表面三次后，将膜片分别置于48孔板内，向各孔依次加入1 mL 2.5%的戊二醛水溶液，于4℃下固定处理4 h.之后除去戊二醛溶液，依次使用25%、50%、75%、95%、100%的乙醇溶液对膜片表面进行梯度脱水处理10 min.真空干燥后喷铂金，使用扫描电子显微镜观察样品表面的血小板粘附情况(仪器型号:INSPECT F，FEI公司，美国).

2 结果与讨论

2.1 表征结果

将测得〛的接触角数据整理为如图2所示的柱状图，从图上可以直观看到，从空白聚氨酯样品到接枝了分子量为5000的聚乙二醇的聚氨酯样品，其静态接触角依次减小，表明了接枝的聚乙二醇的分子量越大，材料表面的亲水性越好.空白聚氨酯表面的亲水性与接枝了聚乙二醇的表面接触角相差比较明显，即接枝了聚乙二醇的聚氨酯材料表面的亲水性明显得到改善，也可推测出聚氨酯表面成功接枝了聚乙二醇.

图2 不同分子量聚乙二醇修饰的材料表面接触角Fig.2 Static contact angle of the different PEG molecular weight coated and uncoated surfaces

为了进一步证明聚乙二醇单甲醚成功接枝在聚氨酯上面，又进行了X射线光电子能谱测试.已知聚乙二醇分子中C/O≈2，表2中接枝了聚乙二醇分子的聚氨酯表面C/O值接近为2；同时，接枝了聚乙二醇后的聚氨酯表面的N/O值与只涂覆聚多巴胺的聚氨酯表面相比，其N/O值大幅度下降，也说明了聚氨酯表面的聚多巴胺涂层被聚乙二醇所覆盖.

总而言之，接触角测试和X射线光电子能谱测试都证实了不同分子量的聚乙二醇在聚氨酯材料表面成功接枝.

表2 不同分子量聚乙二醇修饰的材料表面X射线光电子能谱测试数据Table.2 XPS surface chemical composition of the coated and uncoated surfaces with different PEG molecular weight

2.2 抗菌测试

根据图3的照片，我们可以直观的看到接枝了聚乙二醇的聚氨酯，具有明显的抗细菌粘附效果.而在接枝了分子量2 000和5 000的聚乙二醇的聚氨酯表面，抗菌效果更加明显.

为了更准确地分析菌落计数的结果，我们将计数所得菌落数量整理为如图4的柱状图.如图，我们可以分别直观地看出三个时间段内各个材料表面的抗细菌粘附效果.如培养时间为16 h时，抗细菌粘附效果最好的为PU-DA-PEG5000，其次为PU-DAPEG2000；而培养时间为24 h和48 h时，抗细菌粘附效果最好的为PU-DA-PEG2000，其次为PU-DA-PEG5 000.即总体来看，PU-DA-PEG2000的抗细菌粘附效果相对较好.

图3 在16 h、24 h及48 h下菌落在平板培养基上的生长情况Fig.3 Viable surface colonies of bacterial at 16 h，24 h and 48 h

图4 菌落计数柱状图Fig.4 Viable surface colonies analysis at 16 h，24 h and 48 h

因此，我们在接下来的抗菌测试中，选择了PUDA-PEG2000与PU-DA-PEG5000两种材料进行长时间段的抗细菌粘附测试，即测试两种材料表面抗细菌生物膜的能力.结果如图5显示，在菌液中培养7天后，PU-DA-PEG2000的表面已经生长出均匀又密集的细菌生物膜，而在PU-DA-PEG5000的表面只分布了零星细菌，仍未生成细菌生物膜.因此，PU-DAPEG-5000的抗细菌生物膜能力更强.

图5 分子量为2000和5000的聚乙二醇修饰的材料表面细菌生物膜扫描电镜图Fig.5 SEM images of the surfaces coated with PEG2000 and PEG5000 after 7 days of incubation with S.aureus

2.3 血小板粘附

对于医用植入器材表面，血小板的大量粘附往往会加剧人体内蛋白质及细菌的粘附，并易进一步加剧血栓形成，对人体健康造成威胁.因此，医用生物材料表面抗血小板粘附能力也是材料生物相容性的测试指标之一.本文采用新鲜兔血的血小板进行测试，结果如图6所示，接枝了聚乙二醇的材料表面皆具有良好的抗血小板粘附能力，与接枝的聚乙二醇分子量关系不大，且PU-DA-PEG2000与PU-DA-PEG5000两种材料的抗血小板粘附效果都很显著.从图中还可看出，粘附的血小板多数保持原始的形态，尾足相对不明显，进一步印证了聚乙二醇具有良好的生物相容性，适用于体内环境.

图6 不同分子量聚乙二醇修饰的材料表面血小板粘附扫描电镜图(图A PU图B PU-DA图C PU-DA-PEG1000图D PU-DA-PEG2000图E PU-DA-PEG5000)Fig.6 SEM images of the platelet adhered on the(A)PU surface，(B)PU-DA surface，(C)PEG1000 surface，(D)PEG2000 surface and(E)PEG5000 surface.

3 结论

本实验通过利用聚多巴胺涂层，简单易行地在聚氨酯材料表面成功地接枝了不同分子量的聚乙二醇.不同分子量聚乙二醇修饰的聚氨酯表面分别显示出不同程度的抗菌性能.通过菌落计数的实验结果来看，表面接枝了分子量为2000的聚乙二醇材料抗细菌粘附效果相对较好，又通过细菌生物膜测试显示，表面接枝了分子量5000的聚乙二醇的聚氨酯材料抗细菌生物膜能力更佳.抗血小板粘附测试显示PUDA-PEG2000与PU-DA-PEG5000两种材料的抗粘附效果都很显著.本文为选择聚乙二醇作为材料表面抗菌修饰的实验工作者提供了有效的参考.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Antifouling properties of polyurethane surface modified with polyethylene glycol of different molecular weights

XU De-qiu，GUAN Ya-yuan，LIU Chang，JIANG Yu-chen，ZHANG Ji-ya，LUO Jian-bin
(School of Chemistry and Environmental Protection Engineering，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

This paper presents a comparative study on the antifouling properties of methoxy polyethylene glycol(mPEG)-based polymer coatings prepared by the active catechol and amine groups of the polydopamine(PDA).Three types of mPEG-NH2polymer with different molecular weights were immobilized on a PDA coated polyurethane(PU)substrate，and their molecular weights were 1 000，2 000 and 5 000，respectively.The chemical composition and wettability of the polymer brushes were characterized by X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)and static water contact angle measurements.The dependence of antifouling performance on mPEG molecular weight was systemically tested and compared by bacterial adhesion assays at different time periods and blood platelet adhesion assays.

poly(ethylene glycol)；antifouling；polydopamine；polyurethane

O63；O318.08

A

2095-4271(2016)06-0646-08

10.11920/xnmdzk.2016.06.009

2016-08-27

罗建斌，(1971-)，男，汉族，陕西人，副教授，博士后；研究方向:生物医用高分子材料.E-mail:luojb1971＠163.com

四川省应用基础研究项目(No.2015JY0126)