单细胞测序在肿瘤研究中的应用

李晓洁

（泰州职业技术学院医学技术学院，江苏泰州225300）

单细胞测序在肿瘤研究中的应用

李晓洁

（泰州职业技术学院医学技术学院，江苏泰州225300）

肿瘤是一种基因疾病，其发病机制包括单核苷酸突变、拷贝数变异、插入/缺失等。人类对肿瘤经过数十年的研究，未获得突破性进展。肿瘤研究的关键是理解基因的改变在肿瘤发生、发展过程中发挥的作用。近些年单细胞测序技术的发展为探寻肿瘤发生中基因的改变提供了有力的工具。现通过肿瘤标志运用流式细胞术分选单个肿瘤细胞，并通过细胞测序获得大量信息，为肿瘤的治疗提出一个新方法—个体化治疗。

测序；肿瘤；个体化治疗；拷贝数变异

肿瘤已经成为威胁人类生命的重要杀手［1-5］，而且临床数据显示多种肿瘤的发病率呈现逐年上升趋势［6］，此外多种肿瘤的发生呈现年轻化趋势［7］。从分子生物学的角度，肿瘤被定义为由于染色体上的DNA损伤致使基因突变，导致细胞的生长失控、缺乏分化而异常增生，常侵犯周围的正常组织和器官，最终可散布全身。在过去的几十年，肿瘤研究和治疗没有获得突破性进展［8］，其重要原因就是无法明确肿瘤发生的具体原因。肿瘤作为一种基因疾病，其发病过程中包括一系列的基因变化。Renato Dulbecco［9］指出：人类如果想更好地了解肿瘤，必须关注肿瘤细胞的基因组。2005年，美国宣布实施“肿瘤基因组计划”，并规划在未来13年里找出肺癌、脑癌、卵巢癌等所有困扰人类的癌症基因。基因组测序是一项繁冗的工作，但是随着2009年基因组外显子测序技术的成熟［10］删除对癌症研究没有意义的基因组序列，精简了测序工作，提升了效率。肿瘤基因组测序，首先是获取、纯化肿瘤细胞。但除皮肤癌外，肿瘤多发生在机体的深部，如胸腔、腹腔、颅腔等，即使在B超、CT等引导下进行穿刺取病理组织，也会造成相对较大的创伤，且不适宜连续多次取组织随时监测疾病的发展过程。但肿瘤经常在出现临床症状前血液中已经有循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC），因此通过抽取外周静脉血可以捕获肿瘤细胞。此外，临床样本与生物学样本有着极大的不同，临床样本混合多种细胞，而生物学样本几乎只含有单纯的肿瘤细胞［11］。

1　单个肿瘤细胞的捕获

在肿瘤标志物发现前，研究者多是借助显微切割纯化肿瘤细胞［12-14］，且技术逐步由手工操作提升为机械化操作。Zhuang Z等在高倍显微镜下利用纤细玻璃针成功分离纯化遗传性斑痣性错构瘤细胞，此项操作对操作者要求甚高，主要是手工操作，难以广泛使用。Lee JY等则采用在高倍显微镜下，采用手工与机械相结合的工艺来纯化肿瘤细胞，该项技术在一定程度上降低了对操作者技能的依赖。1998年，美国Litta实验室开发激光捕获显微切割（LMC），其优点是无接触切割、样品无污染、切割精确度高，但激光捕获显微切割不适合大规模分离单细胞。随着肿瘤标志物的不断发现及免疫技术的发展，现多采用肿瘤标志物利用流式细胞术进行分选单个肿瘤细胞。Xiaohui Ni［15］等利用细胞研究试剂盒及DAPI、Cyto、CD45等在外周循环静脉血中筛选肺癌细胞，选白细胞作为阴性对照，白细胞为DAPI+、Cyto-、CD45+，肿瘤细胞为DAPI+、Cyto+、CD45-。Ley等［16］利用高级流式细胞术分离出细胞表面CD13、CD 33和CD117阳性，但CD34阴性的肿瘤细胞，研究者捕获肿瘤细胞对其进行测序。

2　单细胞测序技术的演变

1994年Vasioukhin V［17］等报告了在外周血中的DNA碎片基因分析，2006年Watt［18］等完成了人类表皮干细胞转录组测序。2009年Tang［19］等发表了关于单细胞全转录组分析方法，使单细胞测序逐渐走向完善。Leary RJ［20］、Dawson SJ［21］和Murtaza M［22］等已经将测序工作扩展到整个基因组序列。

3　单细胞测序使治疗个体化

Xiaohui Ni［15］采用单细胞测序研究了一组病理类型同为肺腺癌的患者，通过患者循环肿瘤细胞测序发现：其中一位表皮生长因子受体的基因上存在缺失，缺失的位点是746位的赖氨酸至750位的丙氨酸，该位点是酪氨酸激酶抑制剂的靶点。该位点的缺失会导致蛋白酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物如吉非替尼、索拉菲尼、范得他尼等药效减弱甚至无效。另外几位患者则发现突变位点在磷脂酰肌醇-3激酶的α-催化亚基上，其545位的谷氨酰胺被赖氨酸取代，这一位点的突变可能参与厄洛替尼的药物抵抗；肿瘤蛋白53（TP53）155位的苏氨酸被异亮氨酸取代，155位位于TP53的DNA结合结构域，该结构域具有核酸内切酶的活性，可切除错配核苷酸，结合并调节核酸内切酶修复因子XPB和XPD的活性，该区域的突变可能会导致碱基错配，TP53原有的抑制肿瘤的能力丧失；视网膜母细胞瘤（RB1）基因在320位提前终止，RB1作为细胞周期的负调控因子，与E2F结合，从而阻止细胞通过G1-S，导致细胞周期停滞，当该基因提前终止时，则会丧失其负调控的作用。根据测序结果当TP53和RB1同时突变，临床采用依托泊苷联合顺铂进行化疗可以取得显著的临床效果。这一发现解释了临床上相同病理类型，但对化疗药的敏感性并不一致的现象。Teresa Davoli等发现长时间单倍剂量不足或者肿瘤细胞对化疗药物不敏感可以导致肿瘤基因重塑［23］。此外，同一基因在不同肿瘤类型其突变也不尽相同。例如具有相似流行病学特点的乳腺癌和结肠癌，P53突变谱主要表现为：在结肠癌中G：CA：T转换占79%，而且50%以上转换突变发生在3～5的结构域的CpG，，而乳腺癌仅有13%的转换突变发生在CpG。因此根据个体肿瘤细胞测序结果，选择个体化治疗方式将是未来肿瘤治疗的一个方向。

4　肿瘤基因在肿瘤的发生、发展过程中不断变化

为观测在肿瘤发生、发展过程中，肿瘤细胞的基因是否在不断发生变化，分别在化疗前、一线化疗药物依托扑沙联合顺铂化疗，并出现一定疗效后、一线化疗药物治疗失败，导致疾病发展，采用二线化疗药物—托泊替康化疗后从外周血捕获肿瘤细胞进行单细胞测序，并观察基因拷贝数目变化（CNV）、单核苷酸突变（SNVs）、插入/缺失（INDELs）等。测序结果发现：单核苷酸突变、插入/缺失等在不同时期循环肿瘤细胞中会发生变化。原位肿瘤、循环中肿瘤细胞、转移位点肿瘤细胞三者进行比较发现：与原位肿瘤突变的核苷酸位点相比，循环中的肿瘤细胞和转移位点肿瘤细胞突变的核苷酸位点更为相似。一名肺癌腺癌发生肝转移的病人，其中RB1发生的突变仅仅发现在循环中的肿瘤细胞和肝内转移灶的肿瘤细胞，原位肿瘤细胞并没有发生该位点的突变。后经过多次认证证实这一结果是可靠的，但是基因拷贝变异不会发生变化。

拷贝数变异在正常人的基因组序列中也存在，其和多种基因疾病相关。拷贝数变异是肿瘤基因改变的一个重要形式［24-26］。单细胞测序发现拷贝数变异重复性良好。相同病理类型拷贝数变异相似。例如人白细胞抗原（HLA），在6号短臂出现拷贝数增益与肿瘤的发生、发展密切相关［27］。在肺癌中检测，同为腺癌拷贝变异相似，但不同亚型（例如腺癌和小细胞肺癌）拷贝数变异不同。目前在肺癌发现拷贝数的增加和肿瘤的恶性度呈现正相关。因此通过监测拷贝数变异可以监测肿瘤有无发生恶性度转变。

5　结语

尽管通过单细胞测序在一定程度上揭示了肿瘤发生、发展的信息，但是单个肿瘤细胞的捕获技术仍有待提高。目前在外周血捕获单个肿瘤细胞需要结合多种方式和手段，且不适合大规模的选取；一般10ml血液中仅含有1-10个（CTC），样本量过低，此外血液中含有巨核细胞、内皮细胞、未成熟的血细胞，容易被误认为CTC，且初步无法鉴定该细胞是来源于原位肿瘤还是转移处的肿瘤细胞；目前单细胞测序费用昂贵，难以应用于临床，因此个体化治疗难以推进。此外，与肿瘤发生密切相关的拷贝数变异，经过化疗并不发生变化，如何改变拷贝数变异使得肿瘤恶性度降低目前也尚未解决。

［1］Moreno-Aspitia A.Clinical overview of sorafenib in breast cancer［J］.Future Oncol，2010，6655-6663.

［2］R.A.Smith，V.Cokkinides，D.Brooks，D.Saslow，et al. Cancer screening in the United States，2010：a review of current American Cancer Society guidelines and issues in cancer screening.CA Cancer J Clin，2010，60（2）：99-119.

［3］Shah，M.A.and G.K.Schwartz.Treatment of metastatic esophagus and gastric cancer［J］.Semin Oncol，2004，31（4）：574-587.

［4］Vogelstein B，A.Strillacci，C.Griffoni，et al，RNAi-based strategies for cyclooxygenase-2 inhibition in cancer［J］. J Biomed Biotechnol，2010（8）：28-45.

［5］Peter C Kurniali，Borys Hrinczenko，Anas Al-Janadi，et al.Management of locally advanced and metastatic colon cancer in elderly patients［J］.World J Gastroenterol，2014，20（8）：1910-1922.

［6］L.Zhang，S.Wu，L.R.Guo，et al.Diagnostic strategies and the incidence of prostate cancer：reasons for the low reported incidence of prostate cancer in China. Asian J Androl，2009（11）：9-13.

［7］L.R.Caplan"Top of the basilar"syndrome［J］.Neurology，1980（30）：72-79.

［8］Vogelstein，B.Papadopoulos，N.Velculescu，et al.Cancer genome landscapes［J］.Science，2013，339（6127）：1546-1558.

［9］Renato D.A turning point in cancer research：sequencing the human genome［J］.Science，1986，231（4742）：1055-1056.

［10］Mather B.Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling［J］.Nature，2009，459（7244）：146-147.

［11］Yunbo Xu，Hongliang Hu，Jie Zheng，et al.Feasibility of Whole RNA Sequencing from Single-Cell mRNA Amplification［EB/OL］.（2013-12-23）［2015-12-20］. http：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24455282.

［12］Zhuang Z，Bertheau P，Emmert-Buck MR，et al.A microdissection technique for archival DNA analysis of specific cell populations in lesions＜1 mm in size［J］.Am J Pathol，1995，146（3）：620-625.

［13］Simone NL，Bonner RF，Gillespie JW，et al.Lasercapture microdissection：opening the microscopic frontier to molecular analysis［J］.Trends Genet，1998，14（7）：272-276.

［14］Lee JY，Dong SM，Kim SY，et al.A simple，precise and economical microdissection technique for analysis of genomicDNA from archival tissue sections［J］. Virchows Arch，1998，433（4）：305-309.

［15］Xiaohui Ni，Minglei Zhuo，Zhe Su，et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients［J］.PNAS，2013，110（52）：21083-21088.

［16］Ley TJ，Mardis ER，Ding L，et al.DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome［J］.Nature，2008，456（7218）：66-72.

［17］Vasioukhin V，V.Anker，P.Maurice.P，et al.Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia［J］.Br J Haematol，1994，86（4）：774-779.

［18］Jensen KB，Watt FM.Single-cell expression profiling of human epidermal stem and transit-amplifying cells：Lrig1 is a regulator of stem cell quiescence［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（32）：11958-11963.［19］Tang FC，Barbacioru C，Wang YZ，et al.mRNA-Seq wholetranscriptome analysis of a single cell［J］.Nat Methods，2009，6（5）：377-382.

［20］Leary RJ.Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing［J］.Sci Transl Med，2012，4（162）：154.

［21］Dawson SJ，J.Tsui，D.W.Murtaza.M，et al.Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer［J］.N Engl J Med，2013，368（13）：1199-1209.

［22］Murtaza M，Dawson，S.J.Tsui.D.W，et al.Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA［J］.Nature，2013，497（7447）：108-112.

［23］Teresa Davoli，Andrew Wei Xu，Kristen E.Mengwasser，et al.Cumulative Haploinsufficiency and Triplo-［24］Tang YC，Amon A.Gene copy-number alterations：A cost-benefit analysis［J］.Cell，2013，152（3）：394-405.

sensitivity Drive Aneuploidy Patterns and Shape the Cancer Genome［J］.Cell，2013（155）：1-15.

［25］Iafrate AJ，Feuk，L.Rivera，M.N，et al.Detection of large-scale variation in the human genome［J］.Nat Genet，2004，36（9）：949-951.

［26］Weir.B.A，Woo.M.S.Gete.G，et al.Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma［J］.Nature，2007，450（7171）：893-898.

［27］Santos GC，Zielenska M，Prasad M，Squire JA.Chromosome 6p amplification and cancer progression［J］.J Clin Patho，2007，l60（1）：1-7.

（责任编辑刘红）

Progress in Sequencing Single Cancer Cell

LI Xiao-jie
（Taizhou Polytechnic College，Taizhou Jiangsu 225300，China）

As a genomic disease，cancer involves a series of changes in the genome.These genomic alterations include copy number variations（CNVs），single-nucleotide variations（SNVs），and insertions/deletions（INDELs）. Regardless of the concentrated efforts in the past decades，the key driving genomic alterations responsible for cancer are still elusive.The key of cancer research is how do the changes work.In recent years，the development of Sequencing single cancer cell provides a powerful tool to devise the changes of cancer.Cells were captured with the flow cytometry using tumor maker.genomic analyses of single cancer cell could provide more pertinent information and a new kind of method to personalized treatment of cancer.

sequencing；tumor；personalized therapy；copy number variations（CNVs）

R730.4

A

1671-0142（2016）04-0062-03

李晓洁（1981-），女，河北唐山人，讲师.

2013年度江苏省卫生职业技术教育研究立项课题（J201310，课题负责人：李晓洁）.