氨基糖苷类抗生素混合物对蛋白核小球藻的时间依赖毒性

董欣琦，陈 敏，张 瑾,2，洪桂云

（1. 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥 230601；2. 清华大学新兴有机污染物控制北京市重点实验室，北京 100084）

氨基糖苷类抗生素混合物对蛋白核小球藻的时间依赖毒性

董欣琦1，陈 敏1，张 瑾1,2，洪桂云1

（1. 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥 230601；2. 清华大学新兴有机污染物控制北京市重点实验室，北京 100084）

越来越多的研究表明，污染物在不同暴露时间具有不同的毒性变化规律。以4种氨基糖苷类抗生素，硫酸安普霉素（APR）、双氢链霉素(DIH)、硫酸新霉素(NEO)和硫酸链霉素(STS)为混合物组分，应用直接均分射线法和均匀射线法对4类抗生素设计出6组二元混合体系和4组三元混合体系，每个混合物体系设计5条射线共50条射线，采用时间毒性微板分析法(T-MAT)测定这些抗生素混合物射线在6个暴露时间点(即0、12、24、48、72和96 h)对蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的生长抑制毒性。结果表明，抗生素二元和三元混合物系的50条射线对C.pyrenoidosa毒性均具有明显的时间依赖性，即混合物射线的毒性随着暴露时间的延长而增强；以半数效应浓度(EC50)的负对数pEC50为毒性指标，不同混合物体系的时间毒性变化规律不同，有的混合物从0 h开始，毒性随时间延长逐渐增强，有的从12 h或24 h，甚至48 h后，毒性开始迅速增加；同一混合物体系中不同射线的毒性因组分浓度比的变化而变化，即混合物射线的毒性随毒性大的组分比例增加而增强。

氨基糖苷类抗生素；混合物；蛋白核小球藻；微板毒性分析；时间依赖毒性

0 引 言

已有研究表明污染物的毒性不仅与浓度有关，暴露时间也是一个重要的因素[1,2]，如6种三嗪类除草剂对发光菌Q67的毒性随着时间的延长而逐渐增加[3]。重金属如（Pb，Cd等）对三类水生生物：三叶浮萍、虹鳟鱼和大型蚤均具有明显的时间依赖毒性[4]。

抗生素(antibiotics)被大规模的用于人和动物的疾病治疗，同时以亚治疗剂量添加于动物饲料中，因其含有能干扰其它生物细胞发育功能的化学物质，所以具有预防动物疾病和促进生长的作用。氨基糖苷类抗生素是一种广谱性杀菌剂，因其价廉、高效尤其是对严重的细菌感染有效，而在世界范围内广泛应用[5]。然而，大部分抗生素不能完全被机体吸收，高达85%以上的抗生素以原形或代谢形式经由病人和畜禽粪尿排入环境，经不同途径对土壤和水体造成污染[6]。进入环境中的抗生素会对环境生态系统包括细菌，水生生物，土壤生物和植物等产生危害，甚至产生大量耐药菌，对人类健康构成危害[7]。T.Backhaus等[8]研究表明费氏弧菌对于畜禽和水产养殖的高剂量抗生素敏感。然而，环境中的污染物，并非单独存在，而是不可避免地以各种形式或浓度与环境中其它污染物混合存在，进而对环境生物产生联合毒性效应[9]。混合污染物的累积毒性与相互作用具有更大的潜在风险。目前，对于抗生素的毒性研究虽然很多，但有关氨基糖苷类抗生素的毒性研究很少[10-14]。因此，开展抗生素及其混合物时间毒性的研究具有重要的实际意义。

在我们过去的研究中，发现氨基糖苷类抗生素对蛋白小球藻的毒性具有明显的时间依赖性[15]。因此，本研究在课题组前期工作的基础上，选择了4种氨基糖苷类抗生素作为混合物组分，以蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)为测试生物，分别应用直线均分射线(EquRay)法[16]和均匀设计射线(UD-Ray)法[17]设计氨基糖苷类抗生素的代表性二元和三元混合物体系，运用时间毒性微板分析法(T-MAT)测定这些抗生素混合物体系在6个暴露时间节点(即0、12、24、48、72和96 h)的毒性。研究结果将为抗生素的环境安全性与风险评价提供基础数据和方法参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：4种抗生素：硫酸安普霉素(APR)、双氢链霉素(DIH)、硫酸新霉素(NEO)和硫酸链霉素(STS)均购自上海原叶生物科技有限公司，其基本理化性质见表1。采用milli-Q配制抗生素储备液，保存在棕色瓶中，置于4 ℃冰箱，备用。

表1 4种抗生素的基本理化性质

主要仪器：BioRad酶标仪(美国Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培养箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)和Dragon-lab单道可调移液器(10-100μL)(大龙兴创实验仪器有限公司)[15]。

1.2 混合物设计方法

为了考察四种抗生素混合物毒性随浓度和时间变化规律，直接均分射线法[16]和均匀设计射线法[17]分别用于设计四种抗生素的代表性二元(BM)和三元(TM)混合物体系，每组混合物体系包括5条具有不同浓度比(pi，i=1,2,3,4,5)的混合物射线(Ri,i=1,2,3,4,5)(表2)，每条射线设计12个不同的浓度。

表2 混合物组分及其浓度配比浓度比

BM5 pNEOpSTRBM6 pDIHpNEOTM1 pDIHpNEOpAPRR1 9.673E-01 3.265E-02 R1 4.272E-01 5.728E-01 R1 7.33E-03 1.11E-01 8.82E-01 R2 9.222E-01 7.783E-02 R2 2.297E-01 7.703E-01 R2 3.34E-02 6.34E-01 3.33E-01 R3 8.556E-01 1.444E-01 R3 1.298E-01 8.702E-01 R3 1.99E-02 2.82E-02 9.52E-01 R4 7.476E-01 2.524E-01 R4 6.939E-02 9.306E-01 R4 7.05E-02 2.83E-01 6.46E-01 R5 5.423E-01 4.577E-01 R5 2.896E-02 9.710E-01 R5 2.57E-02 1.73E-01 8.02E-01 TM2 pDIHpSTRpAPRTM3 pDIHpSTRpNEOTM4 pNEOpSTRpAPRR1 8.16E-03 1.00E-02 4.97E-01 R1 3.35E-02 4.12E-02 4.89E-01 R1 4.75E-02 9.64E-03 4.98E-01 R2 7.68E-02 1.58E-01 4.53E-01 R2 1.79E-01 3.68E-01 3.56E-01 R2 3.44E-01 1.12E-01 4.53E-01 R3 2.04E-02 1.87E-03 5.00E-01 R3 8.54E-02 7.82E-03 4.98E-01 R3 1.19E-01 1.68E-03 5.00E-01 R4 9.47E-02 9.64E-02 4.90E-01 R4 2.80E-01 1.07E-01 4.60E-01 R4 4.09E-01 2.37E-02 4.90E-01 R5 3.02E-02 2.48E-02 4.94E-01 R5 1.17E-01 9.60E-02 4.71E-01 R5 1.23E-01 2.11E-02 4.94E-01

1.3 藻种培养、时间毒性测试与毒性计算

蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，其培养基采用SE培养基，培养基的配制和藻培养过程参见文献[15]。

氨基糖苷类混合物体系中的50条射线的时间毒性采用T-MAT测定[15]。为了避免边缘效应，96微孔板的四周36孔加200 ul蒸馏水，在第2列、6列、7列和11列的24个孔中分别加入100 uL蒸馏水作为空白。然后，将配制好的每条混合物射线的12个不同浓度分别加入第3列的6个孔(ci,i=1,2,3,4,5,6)以及第8列的6个孔(ci,i=7,8,9,10,11,12)中，每孔均为100 uL；第4和5列是第2列的平行实验，第9和1 0列是第8列的平行实验。最后在空白和处理孔共60个孔中分别加入已经培养好的藻液100 μL，余下操作详见参考文献[15]。

以污染物对C.pyrenoidosa的生长速率μ的抑制率(E)为毒性指标，计算不同暴露时间终点污染物的毒性：

式中，Ei,j为污染物浓度ci(i=1,2, 3,…,12)在暴露时间终点j(j=0、12、24、48、72和96 h) 对C.pyrenoidosa的生长速率抑制率；μi,j为微板中污染物浓度ci处理孔中CP在暴露时间终点j时的平均生长速率；μ0,j为微板中空白藻在暴露时间终点j(j=0、12、24、48、72和96 h)的平均生长速率。

1.4 时间毒性数据处理

实验数据处理所用到函数模型和方法均参见文献[15]。2个用于描述实验毒性数据的非线性函数Weibull和Logit如式(2)和(3)所示：

式中α、β是Weibull和Logit的位置与斜率参数，E为效应即污染物对绿藻CP的生长抑制率；c是污染物的浓度。

2 结果与分析

2.1 二元混合物对蛋白核小球藻的时间-浓度-效应

Logit函数能较好地拟合抗生素污染物的时间毒性数据[15,18]，且抗生素具有明显的时间依赖毒性。本论文中，Logit函数也能较好地拟合氨基糖苷类抗生素二元混合物对绿藻的时间毒性数据，6个二元混合物体系30条混合物射线的浓度-效应数据点及拟合的浓度-效应(CRC)曲线如图1所示。从图1可以看出，6个氨基糖苷类抗生素二元混合物体系的30条混合物射线对绿藻的毒性也具有明显的时间依赖性，即随暴露时间的延长，毒性逐渐增强。但不同的混合物体系，毒性随时间变化的规律稍有不同，如APR-DIH的5条射线的对蛋白核小球藻的毒性随时间的延长，毒性在逐渐增强，而APR-NEO、APR-STS和NEO-DIH的5条射线在0 ～ 24 h无明显毒性，但24 h后毒性迅速增强，72 h毒性增强很慢甚至不增强。而NEO-STS和DIH-STS的二元混合在0 ～ 12 h几乎没有毒性，在12 h后毒性快速增强。

图1 6组二元抗生素混合物射线在6个时间节点的浓度-效应曲线

续图1 6组二元抗生素混合物射线在6个时间节点的浓度-效应曲线

2.2 二元混合物体系毒性随时间的变化规律

以EC50的负对数值pEC50值为毒性指标，六个二元混合物体系的30条射线的毒性pEC50随时间的变化曲线见图2。从图2可看出，6个二元混合物的pEC50值均随时间的延长而逐渐增大，其中DIH-STS混合体系的5条射线的pEC50值随时间延长的增加速度最快，其它混合物体系的5条射线均是逐渐增加；但6个混合物体系除NEO-STS体系在24 h就能达到50%的效应，其它混合物射线均是在48 h才能达到50%的效应；但同一种混合物体系不同射线的pEC50值差别不同，如NEO-STS 的5条射线的pEC50值差别相对较大，而APR-DIH的差别相对较小，如在暴露时间节点24 h时，APR-NEO混合物5条射线毒性大小顺序：R5＜R4 ＜R3＜R1＜R2；在暴露时间节点48 h时，毒性大小顺序R 1＜R 3＜R 5＜R 4＜R 2;在暴露时间节点7 2 h时，毒性大小顺序R 5＜R 4＜R 3＜R 1 ＜R2；在暴露时间节点96 h时，毒性大小顺序R5＜R4＜R3＜R2＜R1。这可能是由于混合物不同射线的具有毒性差异的组分浓度比不同造成的，如NEO-STS中STS (pEC50=4.68)的毒性大于NEO的pEC50(3.76)[15]，表2中从R 1到R 5中S T S的浓度比越来越大，其pEC50值也越来越来越大；又如DIH和STS的毒性较接近pEC50(4.59)，因此DIH-STS混合体系各条射线的毒性随浓度比变化不明显。

2.3 三元混合物对蛋白核小球藻的时间-浓度-效应曲线

Logit也能较好地描述四组三元混合物体系中20条射线的在不同时间的毒性数据。四个三元抗生素混合物体系中20条射线在不同时间的毒性数据的拟合CRC如图3所示。图3显示，三元混合物毒性也具有明显的时间依赖性，其变化规律与二元混合物稍有不同，即毒性随时间逐渐增强，而不是从某个时间点如24 h突然快速增强。

2.4 4个三元混合物体系20条射线的毒性随时间变化规律

以EC50的负对数值pEC50为毒性指标，四组三元混合物5条射线pEC50值随时间变化的规律见图4。从图4可看出，三元混合物体系与二元混合物的pEC50值随时间变化规律相似，即具有明显的时间依赖性，但4个混合物体系除NEO-STS-APR中的5条射线和DIH-NEO-APR中的R1以及DIHSTS-NEO中的R1射线在24 h就能达到50%的效应，其它混合物射线均是在48 h才能达到50%的效应；不同的混合物体系的pEC50值随时间延长，增加速率不同，其中DIH-STR-APR的pEC50在暴露时间内增加幅度大，曲线较陡，其它3个三元混合物体系的pEC50值增加平缓；同一种混合物体系不同射线的pEC50值差别不同，NEO-STS-APR的5条射线的pEC50值差别较明显，而其它三个混合体系中5条射线的pEC50值差别不明显，可能是由于NEO、STS和APR的差别较大[15]；同一种混合物体系的5条射线在同一时间点的毒性也不相同，如在暴露时间节点24 h时，DIH-NEO-APR混合物5条射线毒性大小顺序：R3＜R5＜R1＜R4＜R2；在暴露时间节点48 h时，毒性大小顺序：R3＜R1＜R5 ＜R2＜R4;在暴露时间节点72 h时，毒性大小顺序：R2＜R1＜R5＜R4＜R3;在暴露时间节点96 h时，毒性大小顺序：R4＜R2＜R5＜R3＜R1。对照中DIH-NEO-APR的DIH的浓度比变化规律与5条射线中DIH浓度比的变化规律一致。

图2 6个二元混合物体系30条射线的pEC50随时间的变化曲线

图3 4组4种抗生素混合物在6个时间节点的浓度-效应曲线

图4 四组三元混合物五条射线在不同暴露时间内pEC50的变化曲线

3 结论

本文应用T-MTA法测定了10个氨基糖苷类抗生素两元和三元混合体系的50条射线对C.pyrenoidosa的时间毒性。抗生素的二元和三元混合物对C.pyrenoidosa的毒性均具有明显时间依赖性，即随暴露时间越长，毒性逐渐增强：在开始的12 h内几乎没有毒性，然后随暴露时间的延长，毒性迅速增强，到达72 h后毒性增加缓慢甚至不再增强。以半数效应浓度(EC50)的负对数pEC50为毒性指标，不同混合物体系的时间毒性变化规律不同，有的从0 h开始，毒性逐渐增强，有的从12 h后开始逐渐增强或快速增强；有的混合物从24 h开始，毒性迅速增强，有的从48 h毒性迅速增强。同一混合物体系中不同射线的pEC50值因组分浓度比的变化而变化，毒性大的组分比例增加，其混合物射线的毒性也相应增强。

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Time-dependent Toxicity of Aminoglycoside antibiotics to Chlorella pyrenoidosa

DONG Xinqi1, CHEN Min1, ZHANG Jin1,2, HONG Guiyun1

(1. Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province, College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China；2. Beijing Key Laboratory for Emerging Organic Contaminants Control, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

More and more researches published have shown that some pollutants have different toxicitychanging laws at different exposure times. Four aminoglycoside antibiotics including apramycin sulfate, dihydrostreptomycin sesquisulfate, neomycin sulfate and strepomycin sulfate being selected as the mixture components, six binary and four ternary mixture systems (containing fifty rays in all) were designed by the direct equipartition ray design and uniform design ray methods, respectively. The toxicities of the fifty rays in six binary and four ternary mixture systems to Chlorella pyrenoidosa were determined by using the timedependent microplate toxicity analysis (T-MAT) method at six different exposure times such as 0, 12, 24, 48, 72 and 96 h. The results showed that all the fifty mixture rays exhibited clear time-dependent toxicity, i.e. toxicity increased with time lengthening. Selecting the negative logarithm of mean effect concentration (pEC50) value as a toxicity index, toxicity changing laws of different mixture systems varied with the exposure time lengthening. Toxicities of some mixture rays gradually increased from the exposure time of 0 h, while the toxicities of other mixture rays gradually or rapidly increased after 12 h or 24 h, even 48 h. The pEC50 values of different rays in the same mixture system changed with the mixture ratios of the component with higher toxicity, i.e., the toxicity of a mixture ray increased with the increasing of mixture ratios of the component with higher toxicity.

Aminoglycoside antibiotics; Chlorella pyrenoidosa; microplate toxicity analysis; time-dependent toxicity.

X13

A

2095-8382(2016)06-067-07

10.11921/j.issn.2095-8382.20160615

2016-01-26

国家自然科学基金(No.21207002)；天津市水质科学与技术重点实验室开放研究基金(TJKLAST-ZD-2014-03)；安徽省高等学校自然科学研究项目(No.KJ2013A067)。

董欣琪(1991-)，女，研究生，研究方向为毒理学。