解脲支原体药敏及对氟喹诺酮类药物的耐药性研究

潘军平 蒋桂芳

解脲支原体药敏及对氟喹诺酮类药物的耐药性研究

潘军平 蒋桂芳

解脲支原体；氟喹诺酮类药物；耐药性；敏感性

非淋菌性尿道炎是临床上常见的疾病，其发病率出现上升趋势,并超过淋病[1]。根据相关研究[2]结果显示，非淋菌性尿道炎主要是由于沙眼衣原体和解脲支原体（ureaplasma urealyticum，Uu）引起，患者发病后主要以尿频、尿急、尿痛等为主，影响患者正常生活和工作[3]。目前，临床上对于非淋菌性尿道炎尚缺乏理想的治疗方法，常规抗生素虽然能够改善患者症状，但是病菌耐药性较高。氟喹诺酮类药物属人工合成广谱抗生素，广泛用于非淋菌性尿道炎患者，但是近年来解脲支原体对非淋菌性尿道炎耐药株不断增加，且报道研究发现多为基因突变引起的氨基酸改变引起[4]。为了探讨解脲支原体药敏及对氟喹诺酮类药物的耐药性和敏感性。本研究选取我院收治的432例患者资料进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年4月—2014年4月本院收治的432例患者中共分离出解脲支原体101株，其中男45例，女56例，年龄16～65岁，平均（47.4±1.3）岁。患者入院时临床表现女性主要以白带增多，部分患者伴有异位、外阴瘙痒等为主；男性则主要以尿道刺痒、烧灼感、尿频、尿急等为主。男性解脲支原体取自尿道内3～4cm处，女性从宫颈内1～1.5cm处取材，对采集标本进行分离和鉴定。患者对实验方案、实验措施等有知情权。

1.2 方 法 研究中所用的Uu检测以及药敏分析试剂Mycoplasma ICS Kit试剂盒均由珠海丽珠试剂有限公司提供；DNA抽提、PCR以及相关试剂均由珠海丽珠试剂有限公司提供；实验中支原体检测以及药敏分析必须严格遵循试剂盒相关操作步骤进行[5]。药敏主要包括四环素类药物，如强力霉素、美满霉素；大环内酯类：交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素等；喹诺酮类：如氧氟沙星、左旋氧氟沙星等。每种抗生素药物均制备两种浓度。强力美素与美满霉素为4mg/L和8mg/L；交沙霉素为2mg/L、8mg/L；克拉霉素、罗红霉素以及氧氟沙星等药物浓度均为1mg/L 和4mg/L。当药敏两孔均为红色时为耐药，药敏孔低稀释度变色，高稀释度变化不明显或不变色为重度敏感。选取1.5mL氟喹诺酮类耐药菌株进行10min离心，离心速度为15 000r/min，离心的半径调整为4.9cm，去除上层清液，采用0.01mmol/L PBS进行洗涤，然后进行2min心，离心速度为13 000r/min，离心半径为4.9cm，去除上层清液，向沉淀物内加入200mg/mL蛋白酶K进行消化2h，灭活5min，离心30s，离心半径4.9cm，速度1000r/min，取10μL作为标准模板[6-7]。

1.3 PCR引物及反应条件 参照相关文献设计的引物，gyrA上下游引物序列分别为：5′-TTGCTGCTT TCGAAAACGG-3′，5′-CTGATGGTAAAACACTTGG-3′；gyrB上下游引物为5′-CCTGGTAAATTAGCTGAC TG-3′，5′-TTCGAATATGACTGCCATC-3′，反应体系含有5μL 10×buffer，浓度为1.5mmol/lmg CL2，0.2mmol/ L dNTP，引物浓度为0.5μmol/L，加入2.5uTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，并采用超纯水将其补充到50μL，根据实验要求设置PCR循环反应条件。扩增完毕后取10μL扩增产物，加入2μL溴酚蓝，并取上层清液进行染色，并进行电泳实验，采用紫外透射反射检测分析仪观察结果。将获得的PCR扩张目的片段经过回收纯化后进行测序，并将耐药株测序结果采用Blast软件和Genbank中Uu3基因序列进行比较，确定基因变化情况[8-9]。

2 结 果

2.1 101株Uu对常用抗生素的药物敏感情况 喹诺酮类药物对Uu的耐药性最高。氧氟沙星耐药30株，耐药率29.90%；罗红霉素耐药24株，耐药率23.76%；阿奇霉素、美满霉素以及克拉霉素耐药均为166株，耐药率15.84%，见表1。

表1 101株Uu对常用抗生素药物敏感情况[株（%）]

2.2 gyrA、gyrB基因扩增及突变分析 本研究PCR扩增中分别得到大小为335bp和310bp的片段，对4株耐喹诺酮Uu进行突变分析。结果显示，2株耐喹诺酮Uu的gyrA302位碱基C-T误义突变使其编码的101位丙氨酸变为缬氨酸；1株在gyrA13位发生突变，但是氨基酸未发生改变，另外1株为突变。

3 讨 论

抗生素治疗非淋菌性尿道炎效果理想，但是随着抗生素的不断使用，Uu对抗生素的耐药率出现上升趋势[10]。本研究显示，喹诺酮类药物对Uu的耐药性最高。交沙霉素和强力霉素对Uu均具有良好的敏感性，但是药物不良反应发生率较高，且药物价格比较昂贵，临床上使用时受到患者家庭经济等因素的限制[11]。氧氟沙星、罗红霉素等耐药性也出现上升趋势，可能和药物长期大剂量使用有关。因此，临床上对于支原体感染患者治疗时应该加强细菌培养和药敏试验检测，提高药物使用合理性，从而降低耐药株发生率[12]。

氟喹诺酮类药药物作用靶位为细菌扩扑异构酶，包括旋转酶和拓扑异构酶。其中，旋转酶主要是由gyrA和gyrB组成的A2B2四聚体结构，并且由gyrA和gyrB基因编码。而拓补异构酶则主要是由C2E2四聚体结构。目前，临床上普遍认为[13]，细菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要表现为靶酶的突变。根据相关研究[14]结果显示，大肠埃希菌旋转酶的突变经过出现在gyrA5′末端第199到318位碱基保守区。而gyrB5′的两个位点，分别为425和447位氨基酸和喹诺酮类药物耐药关系密切。本研究对4株耐喹诺酮Uu进行突变分析显示，2株耐喹诺酮Uu的gyrA302位碱基C-T误义突变使其编码的101位丙氨酸变为缬氨酸；1株在gyrA13位发生突变，但是氨基酸未发生改变，另外1株为突变。解脲支原体对氟喹诺酮类药物产生的耐药性可能还与其他机制和基因有关，尚需要进一步研究和分析。

综上所述，解脲支原体对氟喹诺酮类药物产生的敏感性主要是由于gyrA基因突变引起所控氨基酸发生变化，临床用药应选择针对性的抗生素治疗，提高临床疗效。

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（收稿：2015-08-27 修回：2015-10-26）

浙江省湖州市吴兴区人民医院检验科（湖州 313008）

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