原发性肝细胞肝癌中核不均一核糖核蛋白A1的定位及临床意义

周正君， 王晓怡， 陈二宝， 胡志强， 周少来， 周 俭,2， 樊 嘉,2， 代 智*

1.复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032 2.复旦大学生物医学研究院，上海 200032

论 著

原发性肝细胞肝癌中核不均一核糖核蛋白A1的定位及临床意义

周正君1， 王晓怡1， 陈二宝1， 胡志强1， 周少来1， 周 俭1,2， 樊 嘉1,2， 代 智1*

1.复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032 2.复旦大学生物医学研究院，上海 200032

目的：观察核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNP A1) 在原发性肝细胞肝癌(肝癌)中的定位，初步分析该蛋白定位与肝癌患者临床病理特征之间的相关性及其预测患者术后复发转移的临床价值。方法：由323例肝癌患者肝癌组织构成组织芯片集，采用免疫组织化学染色技术，观察肝组织中hnRNP A1的定位，分析hnRNP A1定位与临床病理特征及患者预后的相关性。结果：hnRNP A1蛋白在正常肝细胞核中表达呈弱阳性，在肝癌组织的细胞核和细胞质中均有不同程度的阳性表达。hnRNP A1在肝癌细胞质中定位的肝癌患者的术后预后最差。结论：hnRNP A1蛋白是较好的独立预后指标，其能准确预测肝癌患者术后的预后。

核不均一核糖核蛋白A1；肝癌；预后

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)家族是一组核内RNA结合蛋白，广泛参与调控RNA转录、外显子剪接、pre-mRNA的成熟和降解以及DNA复制和重组等生物学过程[1]。hnRNPs家族蛋白与肿瘤发生发展密切相关。该家族蛋白成员的异常定位与多种肿瘤的转移复发相关。早期研究[2-5]证实，hnRNP A2/B1可作为肺癌临床早期诊断的参考指标。

核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNP A1)是近年来研究较多的hnRNP A/B亚家族成员之一。其在RNA调节、端粒延长、细胞凋亡、细胞增殖等肿瘤发生、发展机制中发挥重要作用，这为进一步完善肿瘤的诊断、治疗以及预防提供了新的理论依据[6-9]。但其在肝细胞肝癌中的定位及临床意义研究在国内外报道较少。因此，本研究旨在观察hnRNP A1在肝细胞肝癌组织中的定位，初步分析hnRNP A1蛋白定位与肝癌临床病理之间的相关性，探讨其定位在预测患者术后复发转移中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择复旦大学附属中山医院肝外科2003年1月至2004年3月接受的首次进行根治性肿瘤切除并经组织病理学证实为肝细胞肝癌的323例患者。患者术前均未发现远处转移，同时未接受过放、化疗，手术切除等抗肿瘤治疗。患者临床病理资料见表1。本研究通过医院医学伦理委员会审核。所有患者知情同意并签署知情同意书。所有患者手术标本均在术后15 min内采集并立即放入液氮中，于-80℃冰箱保存。

1.2 组织芯片制备 使用直径1.0 mm的组织穿刺针取出石蜡标本的组织芯，有规律地排列在空白蜡块上制备成组织阵列块；将组织阵列块在52℃恒温烤箱中加热融合，使组织芯与蜡块紧密相连；对组织阵列块进行修整，至80%的组织芯曝露；对组织阵列块按4 μm进行常规切片，裱于经10%多聚赖氨酸处理的载玻片上，制成组织芯片。将组织芯片按编号每隔10张抽取1张作H-E染色，镜检判断组织芯片上的样本点完整程度。

1.3 免疫组织化学检测 采用免疫组织化学SP法，参照SP免疫组织化学试剂盒说明书进行。hnRNP A1单克隆抗体由Abcam公司提供。载玻片经0.3%H2O2灭活内源性过氧化物酶、微波抗原修复、5%羊血清封闭后，加按1∶2 000 稀释的hnRNP A1单抗，4℃过夜，再加入二抗，37℃孵育30 min，DAB 显色。其中1张以PBS 代替一抗作为对照，其余步骤不变。结果判断：先后由2名病理科医师采用双盲法观察并拍照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行处理。计数资料的比较采用χ2检验或Fisher精确检验。累积生存时间和累积生存率的计算采用Kaplan-Meier 法；生存检验采用Log-rank检验。单因素和多因素生存分析采用Cox比例风险模型(将单因素分析中P<0.05的变量纳入模型)。检验水准(α)为0.05。

表1 患者临床资料

AFP: 甲胎蛋白；GGT：谷氨酰转肽酶；HCV：丙型肝炎病毒；HBsAg：乙型肝炎表面抗原

2 结 果

2.1 hnRNP A1在肝细胞肝癌组织中的定位 免疫组织化学结果(图1)表明：hnRNP A1蛋白在正常肝细胞核中呈弱阳性表达；在肝细胞肝癌组织细胞核和细胞质中均呈强阳性表达。进一步观察发现，光镜下hnRNP A1表达阳性产物呈棕黄色，呈核型分布、质型分布和核质分布。参考免疫组织化学染色结果，将323例标本依据hnRNP A1定位分布，分成以下3组，核型分布：hnRNP A1蛋白在核中表达(89例)，核质分布：hnRNP A1蛋白在核和胞质中均表达(113例),质型分布：hnRNP A1蛋白在细胞质中表达(121例)。

图1 hnRNP A1在肝组织中的定位

A、B: hnRNPA1在正常肝组织的分布(original magnification: ×100)；C、D、E: hnRNPA1在肝癌组织中的分布，依次为核型分布、核质分布和质型分布 (original magnification: ×100)

2.2 hnRNP A1定位与肝细胞肝癌临床病理特征之间的关系 结果(表2)表明：不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯、肿瘤包膜和TMN分期患者的hnRNP A1定位差异均无统计学意义。

2.3 hnRNP A1定位与肝细胞肝癌患者预后的关系 结果(图2)表明：3组肝癌患者预后差异有统计学意义(P<0.001)，其中hnRNP A1蛋白质型分布患者预后最差。核型分布患者1年、3年、5年的累积复发率和总体生存率分别为17%、91%、35%和75%、43%、67%，质型分布患者1年、3年、5年的累积复发率和总体生存率分别为20%、82%、60%和52%、75%、38%，两组患者的预后差异有统计学意义(P<0.001)。结果显示，肝细胞肝癌组织中hnRNP A1定位异常可能与肝癌细胞的复发转移有关。

2.4 生存统计分析 单因素分析(表3)表明：不同性别、肿瘤大小、血管侵犯、肿瘤包膜、TNM分期患者的累积复发率及总体生存率差异均有统计学意义(P<0.05)；不同AFP水平、 GGT水平、肿瘤数目和肿瘤分化的患者总体生存率差异均有统计学意义(P<0.05)。Cox回归多因素分析(表4)表明：不同hnRNP A1蛋白定位患者术后累积复发率和总体生存率差异有统计学意义(P<0.001)。

3 讨 论

原发性肝细胞肝癌的高转移率和高复发率是影响患者术后预后的两个主要因素[10]。深入研究转移复发过程潜在的分子机制，有助于了解肝癌发生发展的生物学行为，从而指导临床个体化治疗。hnRNP A1是一种肿瘤相关抗原，但有关hnRNP A1与肝癌进展的研究尚处于起步阶段，有待深入探索。

表2 hnRNP A1表达定位与肝细胞肝癌临床病理特征的关系

AFP: 甲胎蛋白；GGT：谷胺酰转肽酶；HCV：丙型肝炎病毒；HBsAg：乙型肝炎表面抗原

图2 hnRNP A1在肝细胞肝癌组织中的定位与患者预后的相关性A：hnRNP A1定位与患者总体生存率的关系；B：hnRNP A1定位与患者累积复发率的关系

表3 单因素分析结果

表4 多因素分析结果

hnRNP A1作为一种核内RNA结合蛋白，是hnRNP家族的核心成员，参与RNA代谢转录、mRNA前体的剪接和加工、mRNA稳定性的调控、核-胞质转运、翻译等过程[1-5]。以往研究[1]表明，hnRNP A1蛋白可以自由穿梭在细胞核与细胞质之间，与前体mRNA形成复合体，协助前体mRNA通过核孔复合体进入细胞质，并与其他蛋白如RNA多聚酶Ⅱ等一起完成对前体mRNA的剪接加工及修饰。hnRNP A1蛋白参与核-质转运、蛋白翻译等过程，这些过程随hnRNPA1蛋白定位的改变而改变[1]。Ma等[11-13]发现，hnRNP A1的定位在原发肠癌和转移复发肠癌患者中的差异有统计学意义。而hnRNP A1在肝细胞肝癌组织中的定位及其潜在临床意义目前国内外鲜有报道。因此，hnRNP A1蛋白定位变化是否为肿瘤发生发展的重要因素及其预测患者术后复发转移的价值亟待深入研究。

本研究发现，hnRNP A1蛋白在肝细胞肝癌组织中的分布形式有核型、质型、核质型3种；而在正常肝组织中hnRNP A1主要在细胞核里表达。本研究在大通量肝癌组织标本组成的组织芯片中，发现肝癌患者以hnRNP A1质型分布居多，其中质型分布患者有121例，占总人数的37.5%，核质型和核型分布的患者分别占35.0%、27.5%。结果表明，在323例肝细胞肝癌患者中，hnRNP A1质型分布患者的预后最差，与其他两种分布形式患者的预后有显著差异(P<0.001)。

以上研究结果提示：肝细胞肝癌组织中hnRNP A1蛋白的异常定位与肝癌转移复发相关。其中，hnRNP A1在细胞质中定位可能是肝癌的恶性表型之一。我们已有的研究结果[14]表明，hnRNP A1蛋白在细胞核内的重要功能之一是参与调控CD44ν6剪接体的生成，提示其在肝癌的侵袭、转移过程中可能发挥重要作用。因此，hnRNP A1有望作为预测肝癌术后复发的参考指标之一，深入研究其分子机制可指导肝癌患者术后个体化治疗。

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[本文编辑] 叶 婷， 晓 璐

The location and significance of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1in hepatocellular carcinoma

ZHOU Zheng-jun1, WANG Xiao-yi1, CHEN Er-bao1, HU Zhi-qiang1, ZHOU Shao-lai1, ZHOU Jian1,2, FAN Jia1,2, DAI Zhi1*

1.Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective：To investigate the location of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNP A1), and to analyze the relationship between the location and clinicopathologic feature and its prognostic significance in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods：The location of hnRNP A1was studied in an independent cohort of 323 HCC patients by immunohistochemistry, the hnRNP A1location and clinicopathologic feature and its prognostic significance in HCC were concluded.Results：For hnRNP A1, there was weak-to-moderate intensity immunoreactivity with nuclear expression in normal liver, while showed cytoplasmic and nuclear loaction in HCC.The cytoplasmic loaction of hnRNP A1is significantly correlated with poor prognosis of HCC patients after operation.Conclusions：The hnRNP A1is a great independent prognostic indicator, which can accurately predict the poor outcome of HCC patients after surgery.

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1; hepatocellular carcinoma; prognosis

2016-10-28[接受日期]2016-12-16

国家自然科学基金青年基金(81401926，81502485).Supported by National Natural Science Youth Foundation of China (81401926, 81502485).

周正君，博士，助理研究员.E-mail: zhou.zhengjun@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990, E-mail: dai.zhi@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160996

R 735.7

A