草鱼鱼鳞胶原蛋白对成骨细胞MC3T3-E1增殖、周期及碱性磷酸酶水平的影响

陈健, 王辉

(1聊城市中医医院,山东聊城252000;2南昌大学北区食品科学与技术国家重点实验室)

草鱼鱼鳞胶原蛋白对成骨细胞MC3T3-E1增殖、周期及碱性磷酸酶水平的影响

陈健1, 王辉2

(1聊城市中医医院,山东聊城252000;2南昌大学北区食品科学与技术国家重点实验室)

目的 探讨草鱼鱼鳞胶原蛋白对成骨细胞MC3T3-E1增殖、周期及碱性磷酸酶(ALP)水平的影响。方法 将体外培养的成骨细胞株MC3T3-E1分为对照组和观察组1～5组，每组5孔。观察1～5 组加入用RPMI1640培养液稀释的草鱼鱼鳞胶原蛋白溶液使胶原蛋白终浓度分别为50、100、200、 250、 300 mg/L，对照组细胞仅加等量RPMI1640培养基正常培养。2 d后倒置相差显微镜下观察各组细胞形态；MTT法观察各组细胞增殖情况(以OD值表示)；流式细胞术检测各组细胞周期分布；裂解各组细胞，收集上清液，用生化仪检测ALP水平。结果 随胶原蛋白浓度的增大，MC3T3-E1细胞生长越来越旺盛，细胞越来越密集，细胞形态以多边形为主，且单个细胞形态结构清晰可见。培养2 d后对照组和观察1～5组细胞OD490值分别为0.521±0.010、0.548±0.021、0.605±0.007、0.612±0.013、0.627±0.020、0.685±0.018。观察2～4组细胞OD490值均高于对照组和观察1组(P均<0.05)，观察5组细胞OD490值高于其余各组(P均<0.05)。从对照组到观察5组，随着草鱼鱼鳞胶原蛋白浓度的升高，S期MC3T3-E1细胞比例呈降低趋势(P均<0.05)，G2/M期细胞比例呈升高趋势(P均<0.05)，G0/G1期细胞比例变化趋势不明显。对照组和观察1～5组细胞ALP水平分别为(14.50±0.55)、(13.33±0.52)、(13.33±1.03)、(14.67±0.82)、(14.67±0.82)、(14.67±0.52)U/L。观察1、2组MC3T3-E1细胞ALP水平低于对照组(P均<0.05)，而观察3、4、5组MC3T3-E1细胞ALP水平与对照组相比，P均>0.05。结论 草鱼鱼鳞胶原蛋白能促进成骨细胞MC3T3-E1增殖，促进成骨细胞MC3T3-E1由S期进入G2/M期，提高成骨细胞MC3T3-E1的ALP水平。

胶原蛋白；草鱼；鱼鳞；成骨细胞；细胞增殖；细胞周期；碱性磷酸酶

胶原蛋白具有美白、保湿、防皱、修复、营养、减肥等美容美体作用[1]，目前已广泛的应用于临床止血、组织工程和药物缓冲等方面[2,3]，但是在骨科应用不多。2015年6～10月，我们观察了草鱼鱼鳞胶原蛋白对成骨细胞MC3T3-E1增殖、周期分布及碱性磷酸酶(ALP)水平的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 成骨细胞株MC3T3-E1，自制草鱼鱼鳞胶原蛋白(I型，电泳纯)，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，核糖核酸酶(RNase)，核因子-κB受体活化因子配基，RPMI1640 培养基(100 ng/mL)，PBS溶液，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，碘化丙啶(PI)，无血清MEM培养液，二甲基亚砜(DMSO)，24孔培养板，96孔培养板，HERAcell150二氧化碳培养箱，DNM-9602型酶标仪，流式细胞仪。

1.2 MC3T3-E1细胞分组及草鱼鱼鳞胶原蛋白应用 成骨细胞株MC3T3-E1在37 ℃恒温恒湿、5 %CO2的培养箱中用RPMI1640培养液进行培养，每隔2～3 d传代一次。取对数生长期的细胞，胰酶消化成单细胞悬液，终止消化并离心，用含有10%FBS和核因子-κB受体活化因子配基的RPMI-1640培养液培养。用RPMI-1640培养液将细胞悬液的密度调整至2.0×105/mL,然后接种于96孔培养板，每孔加入 90 μL 细胞悬液。设对照组和观察1～5 组。观察1～5 组加入用RPMI1640培养液稀释的草鱼鱼鳞胶原蛋白溶液使胶原蛋白终浓度分别为50、100、200、 250、 300 mg/L，对照组细胞仅加等量RPMI-1640培养基正常培养，每组设5个复孔。培养2 d后检测各项指标。

1.3 各组细胞形态观察 培养2 d后，于倒置显微镜下各组MC3T3-E1、Raw264.7细胞形态。

1.4 各组细胞增殖观察 采用MTT法[4]。培养2 d后加入5 mg/mL 的MTT每孔 20 μL，继续培养4 h，终止培养，除去上清液，每孔加入100 μL的DMSO 溶解呈色，轻微震荡，在波长490 nm处用酶标仪测定各孔吸光度OD值。

1.5 各组细胞周期检测[5]各孔细胞用PBS洗涤3次，70%乙醇4 ℃固定，RNase 消化30 min，用50 mg/L碘化丙啶染色2 min，然后用流式细胞仪和流式细胞术检测细胞周期分布。

1.6 各组细胞ALP水平检测[6]每孔加1 mL细胞裂解液冰浴30 min，收集上清液用全自动生化分析仪检测ALP。

2 结果

2.1 各组MC3T3-E1细胞形态比较 倒置相差显微镜下可见MC3T3-E1细胞形态为梭形、多边形，细胞突触长，细胞间胞突相互连接，胞质透明，细胞核较大。随着培养时间延长细胞体积变大，多边形细胞增多，核清晰，生长旺盛。此外，随胶原蛋白浓度的增大，MC3T3-E1细胞生长越来越旺盛，细胞越来越密集，细胞形态以多边形为主，且单个细胞形态结构清晰可见。

2.2 各组MC3T3-E1细胞OD490值比较 培养2 d后对照组和观察1～5组MC3T3-E1细胞OD490值分别为0.521±0.010、0.548±0.0210、0.605±0.007、0.612±0.013、0.627±0.02、0.685±0.018。观察2～4组MC3T3-E1细胞OD490值均高于对照组和观察1组(P均<0.05)，观察5组MC3T3-E1细胞OD490值高于其余各组(P均<0.05)。

2.3 各组MC3T3-E1细胞周期分布比较 各组MC3T3-E1细胞周期分布见表1。由表1可见，从对照组到观察5组，随着草鱼鱼鳞胶原蛋白浓度的升高，S期MC3T3-E1细胞比例呈降低趋势(P均<0.05)，G2/M期细胞比例呈升高趋势(P均<0.05)，G0/G1期细胞比例变化趋势不明显。

表1 各组MC3T3-E1细胞周期分布

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.4 各组MC3T3-E1细胞ALP水平比较 对照组和观察1～5组MC3T3-E1细胞ALP水平分别为(14.50±0.55)、(13.33±0.52)、(13.33±1.03)、(14.67±0.82)、(14.67±0.82)、(14.67±0.52)U/L。观察1、2组MC3T3-E1细胞ALP水平低于对照组(P均<0.05)，而观察3、4、5组MC3T3-E1细胞ALP水平与对照组相比，P均>0.05。

3 讨论

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质。胶原是皮肤、骨、腱、软骨、血管和牙齿的主要纤维成分，具有四级结构，也是细胞骨架的重要成分[7，8]。骨中含有许多类型的胶原蛋白纤维，其中Ⅰ型胶原蛋白含量较多[9～11]，被认为是基本骨基质和成熟骨形成的必要条件[12～14]；骨中含量较少的胶原蛋白主要包括Ⅱ[15]、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ[16，17]和ⅩⅠⅤ以及ⅩⅩⅣ型[18]。胶原蛋白含量增加使机体组织器官的生物活性增强，尤其是可使骨组织韧性及骨量增加。此外，胶原含有极为丰富的羟脯氨酸和羟赖氨酸，来自于胶原的羟脯氨酸是将血浆中的钙运送到骨细胞的运载工具。

成骨细胞是骨组织中的主要骨形成细胞，主要由骨髓间充质干细胞分化而来，在骨合成代谢、软骨内成骨和膜内成骨中起着核心作用。破骨细胞能够通过直接表达和合成骨形成蛋白来促进骨形成。骨胶原蛋白是骨的重要组分，是主要的钙化作用细胞外基质蛋白，在成骨细胞分化过程中也起到重要的作用[19]。骨中胶原蛋白合成增加或摄入胶原蛋白可使骨形态和骨微细结构发生重要变化，使骨韧性增强，松质骨中骨小梁变厚、硬度增大，有利于骨组织健康。

本研究结果显示，不同浓度的草鱼鱼鳞胶原蛋白均能促进MC3T3-E1细胞聚集生长，且随着草鱼鱼鳞胶原蛋白浓度的提高，细胞生长越来越旺盛，细胞形态圆而大，细胞核逐步变多，单个细胞形态清晰。说明草鱼鱼鳞胶原蛋白可能通过促进成骨细胞数量增加发挥其成骨作用，从而进一步提高骨组织韧性及骨量。

本研究结果显示,不同浓度的草鱼鱼鳞胶原蛋白对MC3T3-E1细胞增殖有促进作用，且草鱼鱼鳞胶原蛋白浓度越高，MC3T3-E1细胞增殖越活跃，与上述研究结果相符。

本研究结果显示，不同浓度的草鱼鱼鳞胶原蛋白对MC3T3-E1细胞周期分布有影响。从对照组到观察5组，随着草鱼鱼鳞胶原蛋白浓度的升高，S期MC3T3-E1细胞比例呈降低趋势(P均<0.05)，G2/M期MC3T3-E1细胞比例呈升高趋势(P均<0.05)，G0/G1期MC3T3-E1细胞比例变化趋势不明显。笔者查阅文献后认为这可能是由于胶原蛋白上调MMP-2的表达，激活下游的转录因子Run-2表达，促进MC3T3-E1细胞由分裂前期向G2/M期分化。这种分化同时也促进了细胞成骨的活性。

巨噬细胞在核因子-κB受体活化因子配体刺激下分化为破骨细胞和成骨细胞的过程中，ALP是分化成熟的标志。

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