罗非鱼类立克次氏体病的组织病理学观察

戚瑞荣，唐绍林，崔龙波，雷燕，马家好

（1.广州利洋水产科技股份有限公司，广东 广州 510515；2.广州金水动物保健品有限公司，广东 广州 510515；3.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

罗非鱼类立克次氏体病的组织病理学观察

戚瑞荣1，2，唐绍林1，2，崔龙波3，雷燕1，2，马家好1，2

（1.广州利洋水产科技股份有限公司，广东 广州 510515；2.广州金水动物保健品有限公司，广东 广州 510515；3.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

本文主要研究感染类立克次氏体（Rickettsia-like organism，RLO）的养殖罗非鱼（Oreochromis aureus♂× Oreochromis niloticus♀）肝、脾、肾、肠、鳃和心脏的组织病理变化。感染类立克次氏体的罗非鱼各器官广布粗糙不圆整的白色小结节，这些结节为肉芽肿坏死灶，分层不典型，与周围健康组织的界限不甚明显；严重病变的组织坏死区域较大，与周围明显增生的细胞形成清晰的巨大“肉瘤”状肿物。经吉姆萨-瑞氏染色后，在病变组织内，尤其是脾肾组织的巨噬细胞胞质内可见蓝紫色球状或颗粒样、成簇分布的类立克次氏体。这些发现可为罗非鱼类立克次氏体病的病理学诊断提供依据。

类立克次氏体；罗非鱼；组织病理；组织印片；吉瑞染色

立克次氏体（Rickettsia）系庞大的家族，为多形性革兰氏阴性菌，直径0.5～1.5μm，专性细胞内寄生，在宿主组织细胞有膜结合的胞质空泡内复制[1]，人和多种动物包括鱼都可感染发病，是导致国内外鱼类发生严重传染病的病原体类群[2]。

Mohamed等在埃及发病的河鲀Tetrodon fahaka体内首次发现类立克次氏体。自20世纪90年代以来，鱼立克次氏体病及其综合症已经遍布多个国家和地区，感染十几种经济鱼种，包括细鳞Brachymystax lenok tsinlingensis、大麻哈鱼Oncorhynchus gorbuscha Walbaum、大鳞大麻哈鱼 Oncorhynchus tshawytscha、银鲑Oncorhynchus kisutch、大西洋鲑Salmo salar等[2-8]。鲑科鱼类立克次氏体病的特征主要是肠、肾、肝和脾等器官有弥漫性的发炎和坏死，肝靠近血管的部位有独特的弹坑状损伤，在巨噬细胞和其他感染细胞的细胞质内可以观察到立克次氏体[4,5]。非鲑科鱼类如石斑鱼Epinephelus melanostigma、罗非鱼Oreochromis niloticus、蓝眼清道夫Panaque suttoni、真鲷Pagrosomus major等感染类立克次氏体也出现与鲑立克次氏体（Piscirickettsia salmonis gen.nov.,sp.nov.）病相似的症状和病理变化[2,9-11]。台湾石斑鱼感染类立克次氏体后，内脏组织器官充血，血管可见血栓性损伤、坏死，有结节，感染的组织细胞有大空泡[11]。电镜观察台湾患病的罗非鱼细胞中桑葚状包涵体内有鱼类立克次氏体[12]。真鲷类立克次氏体引起鱼前肠、中肠和后肠的严重水肿及空肠状态，肠上皮细胞的细胞质和微绒毛中有大量类立克次氏体样原核生物及其在发生基质内存在“装配”增殖现象[13]。

本文通过观察云南患病罗非鱼肝、脾、肾、肠、鳃、心的组织切片发现，罗非鱼组织中的白色结节是由类立克次氏体引起，进而研究罗非鱼感染类立克次氏体后各器官的组织病理变化，为该病的临床诊断提供组织病理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

感染发病的罗非鱼采自云南省宁河县当地罗非鱼养殖场，现场观察记录感染鱼的临床及解剖学特征。

1.2 组织切片的制备

取病变器官肝、脾、肾、肠、鳃、心的组织块，固定于Bouin's液中，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片（厚度5μm），苏木精-伊红（H&E）染色，光镜观察。

1.3 组织印片的制备及染色

取病变器官组织，用解剖刀将组织切割出一个整齐的切面，将此切面平行印在载玻片上（轻触一下载玻片即可），待组织印面稍干后，用甲醇固定1min，晾干，4℃保存备用。

对组织印片染色时，先用吉姆萨染液染色15～20min，然后不经水洗直接滴加瑞氏染液染色1min，水洗、晾干，树胶封片后（也可不封片直接镜检）于光学显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 感染类立克次氏体的罗非鱼的症状及解剖学特征

2010年冬季首次在云南发现养殖罗非鱼出现病症，之后每年10月～翌年5月中旬低温期（水温17～25℃）均发病。感染类立克次氏体的罗非鱼在水中上浮、靠边，中午和下午会上来“停尸”（即停在水面一动不动，有人靠近时或会游走），死亡前常常打转。罗非鱼内脏组织尤其是脾、肾组织可见白色结节，呈严重的“肉瘤”状（图1）。

2.2 感染类立克次氏体的罗非鱼内脏组织病理变化

切片观察发现：感染类立克次氏体的罗非鱼肝、脾、肾、心组织中均出现肉芽肿结节性坏死灶，这些坏死灶长椭圆形、边界不圆整、分层不典型，常多个大小不一的坏死灶融合在一起；坏死灶与周围组织界限不清；肝组织中可见少量肉芽肿坏死灶，肝细胞固缩、有崩解（图2-1、图2-2）；脾组织中可见大量的肉芽肿坏死灶，淤血，脾实质组织细胞崩解、消失（图2-3、图2-4）；肾组织中有大量肉芽肿坏死灶，肾固有组织细胞崩解、消失（图2-5、图2-6）；肠腔内有少量食物及少量脱落坏死细胞，肠上皮近腔端有坏死；鳃轻微淤血，鳃小片上皮肿胀，细胞脱落、坏死、溶解，形成许多溶解性的空腔，鳃小片间轻微细胞增生；心肌中可见个别肉芽肿，心肌纤维坏死（图2-7、图2-8）。综合发病罗非鱼的剖检特征和组织病变特征，最具病理诊断意义的特征是：各器官普遍出现白色小结节，结节粗糙、不圆整；这些结节的显微结构为肉芽肿坏死灶，与周围健康组织的界限不甚明显，分层不典型；严重病变的组织、坏死区域和周围明显的细胞增生形成清晰的大“肉瘤”状肿物。

图1 罗非鱼患类立克次氏体病时内脏组织的外观特征Fig.1 Visceral tissue characteristics in tilapia diseased by rickettsia-like organism（RLO）

2.3 感染类立克次氏体的罗非鱼内脏组织印片染色结果

发病罗非鱼内脏组织印片经吉瑞染色后，在脾、肾的巨噬细胞胞质内观察到蓝紫色、球状或颗粒样、成簇的菌体（图3），初步确定为类立克次氏体。

图2 患类立克次氏体病的罗非鱼组织病变特征Fig.2 Histopathological characteristics in tilapia diseased by RLO

图3 患类立克次氏体病的罗非鱼组织印片Fig.3 The tissue imprints stained with Giemsa-Wright in tilapia diseased by RLO

3 讨论

无论是鲑科鱼类，还是非鲑科鱼类，感染类立克次氏体后的病理解剖学特征和最具病理诊断意义的特征都是内脏出现白色结节[4,5,9,11]。感染类立克次氏体的罗非鱼肝、脾、肾等组织，尤其是脾肾组织，均有大量乳白色或灰白色的结节，严重的呈巨大“肉瘤”状肿物。这些乳白色或灰白色的“肉瘤”样大结节，在光镜下为大小不一融合在一起的多个肉芽肿。肉芽肿普遍存在，但在各组织中的数量及其中心坏死区的大小等有差异。感染RLO的罗非鱼的病变特征为组织细胞严重变性、坏死及存在大量的慢性肉芽肿炎症，与其他鱼类和合浦珠母贝Pinctada fucata的病变相似[4,5,9,11,14]。郭琼林等[15]在感染RLO的乌鳢Ophiocephalus argus的肝、脾、肾等组织中也观察到类似的肉芽肿。但病变较严重的罗非鱼组织中，较大的组织坏死区域和周围明显的炎性增生形成边界清楚可见的类似“肿瘤”样的团块，即本文中病检时观察到的巨大“肉瘤”状肿物。

检测鱼立克次氏体的“金标准”是用易感鱼类的细胞系进行细菌分离培养[16]，但检测条件比较苛刻，现场很难进行无菌操作，且鱼立克次氏体对低浓度抗生素敏感，不适合现场检测。有研究人员利用血琼脂培养基成功分离培养出鲑立克次氏体[17]，但培养基营养要求高，现在还没有标准的培养方法。目前一般用组织印片或者涂片的吉姆萨染色、革兰氏染色等判定类立克次氏体。本实验发现，吉姆萨-瑞氏染色后比较容易观察到组织印片中的类立克次氏体。

罗非鱼类立克次氏体形成的结节与单纯诺卡氏菌感染引起的分层明显的典型结节不同[18]：前者外观不圆整、连成一片；组织切片光镜下观察，结节分层不典型，与周围健康组织分界不明显，常多个大小不一的结节性坏死灶融合在一起。

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Histopathological Observation of Disease of Rickettsia-like Organism in Tilapia（Oreochromis niloticus）

QI Rui-rong1,2,TANG Shao-lin1,2,CUI Long-bo3,LEI Yan1,2,MA Jia-hao1,2
（1.Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co.Ltd.,Guangzhou 510515,China; 2.Guangzhou Jinshui Animal Health Products Co.Ltd.,Guangzhou 510515,China; 3.College of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China）

The histopathological changes in liver,spleen,kidney,intestine,gill and heart were described in tilapia（Oreochromis aureus♂×Oreochromis niloticus♀）infected by rickettsia-like organism（RLO）.The tilapia infected by RLO is most pathologically and anatomically characterized by rich in rough small white nodules without round in shape in diagnosis.The microscopic observation revealed that the nodules are the atypically stratified granuloma in structure without obvious boundaries between the necrosis tissues and healthy tissues.It appears that the nodules are obviously a huge“sarcoma”due to the large and obvious cell proliferation in the tissue of severe lesions.The RLO are bluish violet,spherical or particles and clustered,and observed in the lesion in tissue imprint stained by Giemsa-Wright,especially in the macrophages of spleen and kidney.The findings can provide evidence for pathologic diagnosis of the disease of rickettsia-like organism in tilapia.

rickettsia-like organism;tilapia;histopathology;tissue imprint;Giemsa-Wright staining

S941.42+9

A

1005-3832（2016）03-0021-04

2016-03-05

国家科技支撑计划项目（2012BAD17B01）.

戚瑞荣（1986-），女，硕士研究生，从事水产动物疾病研究.E-mail:qrr1177@163.com