微生物介导厌氧甲烷氧化反硝化过程及其反应机制探讨

陈黄曌　鲁　荔　余海尤　邓晓旭　潘春梅*

（1河南牧业经济学院生物工程学院河南郑州4500462广东省生态环境与土壤研究所广东广州510650）

微生物介导厌氧甲烷氧化反硝化过程及其反应机制探讨

陈黄曌1鲁荔2余海尤1邓晓旭1潘春梅1*

（1河南牧业经济学院生物工程学院河南郑州4500462广东省生态环境与土壤研究所广东广州510650）

微生物进行的厌氧甲烷氧化反硝化过程是减少自然环境中甲烷这一温室气体排放的重要生物途径，即反硝化型甲烷厌氧氧化(denitrifying anaerobic methane oxidation，DAMO)。反硝化型甲烷厌氧氧化是指在厌氧条件下以甲烷作为电子供体，NO2-/NO3-作为电子受体的反硝化过程。Candidatus Methylomirabilis oxyfera细菌和Candidatus Methanoperedens nitroreducens古菌是参与DAMO过程的2类主要功能微生物。深入了解微生物介导的DAMO的发生机理以及影响因素，有助于更好地理解碳氮耦合在生物地球化学循环中发生的重要作用，为DAMO工艺的开发与应用提供理论依据。本文从功能微生物的富集、影响因素、生理特性、生物代谢与反应机制等方面对DAMO的最新进展进行阐述，并探讨了DAMO未来的研究方向与应用前景。

反硝化型甲烷厌氧氧化（DAMO）碳氮耦合；反应机制Candidatus Methylomirabilis oxyfera

甲烷是一种重要的温室气体，等物质量的CH4所引起的温室效应是CO2的23倍，在全球气候变暖中“贡献”了约20%[1]。众所周知，湿地是甲烷的重要排放源，占所有天然甲烷排放源的70%，占全球甲烷通量的20%左右[2]。同时，湿地也是氮素的源、汇或转换器，能够截留和过滤大量陆源氮素污染物，具有“自然之肾”之称[3]。微生物是自然生态系统的重要组成部分，在氧化-还原交替作用下，参与碳氮等关键元素的生物地球化学循环过程，对湿地生态系统碳氮形态转化迁移、能量流动和维系碳氮生态平衡方面发挥不可替代的作用[4]。微生物是自然界中甲烷的主要生产者，其贡献率高达69%，但是大部分甲烷在到达大气圈之前已被消耗，例如湿地产生的50%的甲烷会被消耗掉[2]。这种重要的微生物引起的甲烷汇通常被认为只与需氧的甲烷营养细菌有关，它们可以利用氧气作为电子受体来消耗甲烷[3]。在生态系统中，当氧气消耗殆尽，甲烷也可以在厌氧条件下转化[5]。因此，微生物甲烷厌氧氧化是地球上甲烷减少的重要途径之一。

甲烷的厌氧氧化耦合硫酸盐还原的这一过程已被证实是控制海洋甲烷排放的重要途径，在海洋碳循环中发挥着不可替代的作用。但是根据化学反应热力学预测，厌氧条件下NO2-/NO3-更容易成为微生物介导的甲烷厌氧氧化的电子受体，即反硝化型甲烷厌氧氧化（Denitrifyinganaerobicmethaneoxidation,DAMO）过程[5]。

作为碳氮循环的重要桥梁，深入了解DAMO过程及其生物学机制对加深全球碳氮循环的理解具有重要意义。本文简要总结了几年来国内外关于微生物介导的反硝化型甲烷厌氧氧化过程的研究进展，阐述了DAMO功能的生物学机制以及影响因素等，并探讨了DAMO过程在污水生物脱氮中的应用以及未来研究发展方向。

1　DAMO微生物——连接碳循环和氮循环的重要桥梁

微生物催化的DAMO过程耦合了碳氮代谢，是连接碳氮循环的纽带，目前对该方面的研究尚处于初级阶段。上世纪70年代，Mason等[5]试图分离和富集具有DAMO功能的微生物，但未成功。此后较少的研究也仅限于对发现DAMO过程这一现象地描述，但对于哪些微生物在该现象中发挥重要功能依然是未知数。直到2006年，Raghoebarsing等[6]发现海洋沉积物中的甲烷含量急剧下降，首次认识到甲烷的减少可能是由微生物介导甲烷厌氧消耗所造成的。研究者们利用富集培养，第一次证实甲烷氧化可以耦合亚硝酸盐还原，该生物过程被称之为亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化（Nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，N-DAMO）。Raghoebarsing团队应用同位素标记研究发现负责催化DAMO反应的微生物主要是NC10门细菌和进化关系远离的ANME-2（甲烷厌氧氧化菌）古菌。

系统发育树表明，NC10门细菌属于非培养的、只能通过环境基因序列定义的新亚门。古菌在系统发育树上的地位介于ANME-2和甲烷丝状菌(Methanosaeta)之间。FISH探针检测到这两类功能微生物的存在：NC10门细菌呈细杆状、1μm长、0.3μm宽、DNA聚集在细胞的中心；古菌呈球形、聚集成3～6μm的圆形[6]。2009年，Hu等[7-8]同样发现上述细菌和古菌参与了DAMO，并认为NO2－是NC10细菌生长的关键选择因子。与上述发现不同，Ettwig等[9-11]认为DAMO反应可单独由NC10细菌完成，运用宏基因组测序组装分析，将这株优势细菌命名为‘Candidatus Methylomirabilis oxyfera’。2013年，Mohamed等[12]富集培养到一个可催化DAMO反应的ANME-2的单个种群，将该古菌群命名为Candidatus‘Methanoperedens nitroreducens’，归属于Methanoperedens科，它是一种直径1～3μm的不规则球菌，通常以类似八叠球菌的族群方式存在，中温(22～35℃)、pH 7.0～8.0条件下生长。至此，这些研究为参与DAMO过程中的微生物揭开神秘面纱。但是，受环境样品纯培养分离技术条件的限制，导致只能反映极少数DAMO微生物的信息，不能充分反映特定生态系统DAMO微生物的整体活动蓝图。

国内学者对DAMO微生物的研究起步较晚，研究基础较为薄弱，且多集中于DAMO微生物的富集与检测研究[13-17]。Yang等[13]利用特定引物，在中国两个天然盐湖的表面沉积物中，发现了N-DAMO和厌氧氨氧化细菌的存在。蔡琛[14]采用厌氧产甲烷颗粒污泥、农田水稻土壤和淡水河道沉积物作为接种物，成功富集培养了DAMO微生物NC10门细菌。Shen等[15-17]在中国东海椒江流域和钱塘江流域采用分子生物学技术也检测到N-DAMO微生物。

近年来，我国温室气体减排压力增大，氮素污染已不容忽视，而DAMO过程是最新的耦合碳氮循环的发现之一，具有很好的环保优势和经济优势。所以，有必要对催化DAMO的微生物进行更为深入的探索研究，以期为甲烷的资源化利用、氮素污染地深度脱除提供理论和实践基础，同时也丰富了国内碳氮循环耦合研究的理论基础。

2　DAMO微生物的分布特性与生长影响因子研究

DAMO过程受许多物理、化学和生物因子等外界条件的影响。目前该领域的研究者已从许多的自然生境中富集或检测到DAMO微生物，例如，沟渠沉积物[5]，废水活性污泥[7-8]，盐水湖沉积物[13]及水稻土壤[14]，湖泊与河口沉积物[16-17]等。Katharina[5,9-10]利用沟渠底泥为接种物进行富集培养，从而检测到相当数量的NC10门细菌和古菌。蔡琛[14]首先在土壤中检测到反硝化型甲烷厌氧氧化微生物并对其进行了富集培养。随着分子生物学技术的不断发展与完善，16S rRNA和pmoA基因分子生物标记被用于确认NC10门细菌有关M.oxyfera细菌及其多样性的检测[17]。研究表明，16S rRNA和pmoA基因分子生物标记检测到活性污泥、湖泊河口沉积物人工湿地也是DAMO微生物适合生存的环境[14,16]。综上，DAMO微生物多分布于淡水湿地生态系统，群落结构与丰度存在一定空间差异。然而对于其他环境DAMO微生物分布特征还不清楚，并且DAMO微生物随时间和空间二者梯度的变化会有怎样的响应也有待于进一步研究。

由于DAMO微生物在天然环境中活性较低，并受多种外界因子的影响，对该过程的机理探索可以借助富集培养来实现。前期学者研究证明了不同的电子受体（NO3-和NO2-）、培养温度等都会对DAMO微生物菌群具有选择性，不同程度影响DAMO活性[7-9,14]。

电子受体（NO3-和NO2-）对DAMO微生物群落结构具有直接影响。Hu等[7-8]研究比较了这两种电子受体后发现，以NO3-为电子受体的富集培养物具有稳定的DAMO微生物群落结构和DAMO活性；以NO2-为电子受体的富集培养相对较易，但是培养物中高于1 mmol·L-1的NO2-会对N-DAMO过程产生不利影响，古菌会随着NO2-浓度的增加而减少，最后消失。以NO3-为电子受体成功富集N-DAMO的公开报道更少，富集更慢且都存在Anammox细菌或N-DAMO细菌的协同作用[9]。

不同的培养温度，DAMO微生物富集培养的结果也会差异显著。纬度对微生物的生物活性具有极大关系，研究表明高温可以增加DAMO微生物的活性，但是甲烷溶解度会明显降低，使得甲烷可获得性降低[14]。因此，在进行温度优化选择时，需要考虑这两种因素的共同效应，才可获得加快DAMO过程的最优温度条件。

3　微生物DAMO耦合反应机制研究

虽然过去十年对DAMO过程的探索已积累了可观的研究成果，奠定了一定研究基础。但由于DAMO微生物的倍增时间较长（1～2周），富集培养及纯培养的分离与鉴定均比较困难，所以限制了DAMO反应机制的研究以及NC10细菌生理生化特征的揭示[9]。目前,将DAMO机制解释比较明确的是Ettwig[11]所提出的M. oxyfera细菌催化DAMO过程的理论模型。作者对宏基因组序列进行分析组装，并结合转录组学和蛋白组学分析，预测了涉及CH4和NO2-代谢的中心途径，发现M.oxyfera具有编码好氧甲烷氧化的全部基因，但是缺少催化完整反硝化过程所需的某些基因（编码N2O还原酶基因）。Ettwig等利用同位素标记实验证明M.oxyfera可以自身产生氧气，并推测该菌胞内可能存在某种酶，催化2分子的NO通过歧化反应生成O2和N2，其中3/4的O2用于进行CH4氧化。Shen等[16-17]认为在没有氧气源，没有光照的情况下，DAMO的功能微生物NC10门细菌将NO2-分解为NO和O2，然后用生成的O2来氧化甲烷获得能量，表明在植物出现之前细菌就已在地球上制造氧气，弥补了地球上氧化过程“缺失的一环”。

2013年，Mohamed等[12]对古菌在DAMO过程中所扮演的重要角色加以阐释作者利用宏基因组学、单细胞基因组学和宏转录组学等分子技术揭示M.nitroreducens基因组中包含完整的产甲烷途径所需的mcrABCDG和mer基因，甲烷氧化为二氧化碳所需要的全部基因都高度表达。C-13同位素标记实验证明ANME-2d通过基因水平转移从细菌中获得NO3-代谢相关的功能基因，以NO3-作为最终电子受体，通过反向产甲烷方式，进行甲烷的厌氧氧化。在NH4+存在的条件下，厌氧氨氧化细菌与M.oxyfera竞争NO2-，并占据优势地位，与ANME-2d通过共营模式将产生的NO2-还原成N2，但是无法得知古菌是否可以独立完成硝酸盐完全还原过程。

4　结论与展望

综上，DAMO过程的研究还存在明显的不足，尚需深入和完善，主要表现在：（1）DAMO微生物在不同生境中时间和空间分布特征尚不明确，并受CH4和NO3-/NO2-的分布数据局限，无法解释人类活动对DAMO微生物产生的影响；（2）外界影响因子对DAMO微生物生长、群落结构及活性影响的研究报道有限，尚需加强该方面的研究，以期为工程应用奠定基础；（3）目前，DAMO微生物单菌分离与鉴定比较困难，无法解释古菌和细菌在DAMO过程中各占据怎样的地位，并且由于缺乏中间代谢产物的检出及关键酶的分离鉴定，限制了DAMO微生物作用机制的明确阐释。

此外，反硝化型甲烷厌氧氧化已被证实广泛存在于各种环境中。在实际应用方面，反硝化型的甲烷厌氧氧化为污水处理脱氮工艺的设计和发展提供良好的理论基础。目前，污水处理厂一般根据传统硝化-反硝化原理进行脱氮，此类工艺不仅耗能，而且当进水有机物碳源不足时需要外加碳源。DAMO耦合了硝态氮还原和甲烷氧化，基于这一原理的废水处理技术，能够为生物脱氮提供经济、清洁的碳源。同时可以利用甲烷产生更少的N2O，减少废水处理中温室气体的排放，并减少污泥的处理成本[1,11]。

总之，反硝化型甲烷厌氧氧化具有显著的经济和环境效益，应深入加强反硝化型甲烷厌氧氧化的相关研究，同时也应积极开展探索和推进反硝化型甲烷厌氧氧化在污水处理中的应用研究。

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陈黄曌（1986—），男，河南郑州，硕士研究生，助教，从事发酵微生物生理生化研究工作。