EMS诱变西瓜突变体库的构建及表型分析

侯 艳，朱子成，朱娜娜，陈克农，栾非时，王学征*

(1 农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨150030；2 东北农业大学 园艺学院，哈尔滨150030)



EMS诱变西瓜突变体库的构建及表型分析

侯 艳1,2，朱子成1,2，朱娜娜1,2，陈克农1,2，栾非时1,2，王学征1,2*

(1 农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨150030；2 东北农业大学 园艺学院，哈尔滨150030)

采用1.0%诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理西瓜品系W1-17种子9 h，然后对M1和M2代群体单株在叶、花、茎、育性、分支习性等方面进行表型变异观察，同时选取M2代典型变异株系，利用23对西瓜SSR引物进行分析鉴定，构建西瓜突变体库。结果表明：(1)EMS诱变使M1代幼苗形态呈现出叶畸形、叶褶皱、部分黄化、花畸形、雄花不散粉、卷须畸形、矮小、生长缓慢、不育等特异性状，获得由1 252个单株组成的西瓜突变体M1群体，群体总变异频率为18.33%。(2)M2代共筛选到205个突变植株，40种表型变异，表现在子叶性状(黄化、扭曲不对称、折叠等)、叶和茎性状(叶黄化、变小、裂刻变深，茎变细，节间变短，分支少等)、花性状(花变大，花色变浅，两性花，花瓣皱缩、部分退化、数目突变，柱头畸形，雄蕊不成熟等)和其他性状(生长缓慢、不育等)等方面，总的表型突变率达到了19.59%。(3)针对M2代10个典型变异植株，通过SSR引物分析发现有9份材料在DNA水平上有变异。本研究初步构建了含有120个M1代家系及1 051株M2代植株、40种表型变异的西瓜突变体库。

西瓜；甲基磺酸乙酯诱变；突变体库；SSR

西瓜(Citrulluslanatus)是重要的园艺作物，具有很高的食用价值和营养价值。中国是世界上西瓜种植面积最大的国家，西瓜生产地位不断上升，选育具有优异性状的品种是提高生产水平和效益的根本[1]。西瓜起源于非洲，原本是野生物种，后来经人为驯化为可食性西瓜。但在长期的育种过程中，人为选择目标性状导致遗传基础狭窄。目前，研究者们已经把眼光从传统育种转移到种质资源创新中，希望找到西瓜自身不具备的优良性状。近几年的研究显示，通过辐射诱变、太空诱变和自然突变等获得突变植株，从而进行重要基因挖掘，加快了西瓜种质资源的创新进程[2-5]。

目前，继模式植物拟南芥全基因组测序成功之后，番茄[6]、黄瓜[7]、西瓜[8]、甜瓜[9]、甘蓝[10]、油菜[11]等作物全基因组测序也相继完成，从中获得了大量的基因组序列，但却不知其功能，因此利用生物信息学手段对物种间的同源序列进行比较分析研究，促使基因组学研究迅速进入后基因组学时代，其着重研究的内容是对目标性状基因的挖掘与功能鉴定。具体来说，研究者们着重研究植物各个基因的功能，进一步挖掘它们在植物的生长发育过程中是如何协作的。通过逐一分析寡基因和多基因的突变表型以及不同基因在“时空隧道”中的表达，从而准确地鉴定每个基因的功能以及它们之间的互作关系[12]。因此，少数自然基因突变植株早已不能满足蔬菜遗传育种的研究要求，最大限度地涵盖全基因组突变体库的创建和应用已成为基因功能研究最高效的方法之一。

与其他诱变方法相比，化学诱变因其低成本、易操作、高专一性，产生点突变频率高, 而出现染色体畸变频率低等特点，所以其应用最为普遍[13]。与其他化学诱变剂相比，虽然甲基磺酸乙酯(EMS) 诱变也产生一定比例染色体结构和数量方面的双重变异，但其重点是产生由单一碱基对变化所形成的点突变。因为在DNA 水平上发生变化，在植物体上出现原来未出现的性状，可能是由原有等位基因的变异导致的。并且EMS诱导形成的突变体多为显性突变，因此对突变体筛选的操作更为简单。在蔬菜遗传育种研究中，EMS被证明是效率高且负面作用小、使用范围最广的诱变剂[14]。EMS无论从突变类型还是突变率来讲，都是构建突变体库的最佳诱变剂。目前，油菜[15]、小麦[16]、水稻[17]、大豆[18]、番茄[19]、黄瓜[20]、甜瓜[21]等植物EMS 突变体库均已成功构建，它们在育种及其功能基因组研究中发挥了重要作用。

创建突变体库筛选突变体可以为西瓜育种提供新的种质材料，从而推进西瓜种质创新。本研究以东北农业大学西甜瓜育种研究室自育的西瓜品系W1-17为材料，以EMS 为诱变剂，处理西瓜W1-17种子以创建突变体库，调查M1和M2代植株主要农艺性状，初步筛选突变体，进行突变表型鉴定和分析，为进一步构建西瓜突变体库、拓宽西瓜资源遗传背景和开展西瓜功能基因组学研究提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

供试西瓜材料W1-17由东北农业大学园艺学院西甜瓜研究室提供的高代自交系，果肉红色、肉质脆嫩、口感极佳且具有早熟和适应性广等特点。诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)购于美国 Sigma 公司，为无色溶液(区别于其公司生产的固体 EMS 诱变剂)。

1.2 试验方法

1.2.1 种子诱变处理 EMS处理西瓜种子最佳浓度和时间的确定参照前期实验结果[2]，处理过程如下：将 W1-17西瓜种子用指甲刀磕口后，100粒为1个处理；在通风橱中浸入20 mL浓度1.0%EMS中，然后在28 ℃的摇床上震荡9 h；浸种结束后，在通风橱中每个处理加入 1 mol/L 硫代硫酸钠(Na2S2O3)10 mL，混匀后，将溶液倒掉；然后再加入 20 mL 100 mmol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)，轻摇 5 min，将溶液倒掉，再用100 mmol/L Na2S2O3洗3遍；加入20 mL 蒸馏水轻摇5 min，将溶液倒掉，用水洗 3 遍；将处理完毕的种子平铺在湿润滤纸上，稍干后，在 28 ℃培养箱内进行催芽。

1.2.2 M1代试验设计 2013年5月，将处理后的种子播种于园艺实验中心温室试验田内，出苗后记为Ml代植株。定植前统计成活株数，观察Ml代的各种农艺性状，标记后拍照记录，6月份自交授粉，8月份收瓜留种。

1.2.3 M2代试验设计 2014年3月，从M1代收获的种子中挑选部分进行培育，每份种子培育出的植株为1个M2代株系，各在试验田种10株单株，不足10株的定植所有成活苗，收获的种子收入种子库。M2代出苗后将野生型作为对照，观察、记录西瓜生长情况和突变情况，计算突变频率。在此期间，记录典型的性状变异材料。2014年8月按单株收获并保存种子于种子库。

突变频率=突变株数/成活总株数×100%。

1.2.4 M3代试验设计 将具有典型变异性状的M2代材料单株收获后留种，取不同变异单株种子在室内种植，提取幼苗DNA用于SSR分子检测。DNA提取参照Saghai-Maroof等[22]方法，略作修改。选用Zhang等[23]发表的西瓜核心引物23对，由金唯智有限公司合成。西瓜SSR-PCR反应体系及程序参考盛云燕等[24]和张法惺等[25]略有改动。PCR反应总体系为20 μL，PCR扩增反应在PE-9600型和TGRADIENT型PCR扩增仪中进行。反应体系组成为：模板DNA(30 ng/μL)1 μL，引物(2 μmol/L)2 μL，10×Buffer(含Mg2+15 mmol/L)2 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL，Taq酶(2 U/μL)0.2 μL，无菌去离子水14.5 μL，总体积20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，48 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 90 s，38 个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃ 保存。PCR完成后，将PCR产物同3 μL 10×Buffer离心混合后，置于4 ℃冰箱冷却待用。将PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计不同突变类型与野生型间的谱带差异。

1.3 性状调查标准与数据处理

西瓜性状调查参照《西瓜种质资源描述规范和数据标准》[26]。数据处理使用DPS(Vol. 7.05)统计软件完成，采用Microsoft Excel 2003 软件进行平均值和作图分析。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变西瓜突变体库的构建及突变体表型分析

2.1.1 M1群体突变表型筛选 将经过EMS处理过的西瓜W1-17种子播种于温室，最终获得了由1 252个单株组成的西瓜突变体库M1群体。对M1群体单株全生育期的主要农艺性状进行了调查和分析，结果发现，EMS诱变不仅抑制和延迟了西瓜W1-17种子的发芽和成苗[2]，同时对M1代幼苗形态产生影响，使之呈现出一些特异性状，野生型植株生长正常，叶片裂刻中等，雌雄异花同株(图1,10～12)。而M1代植株则出现了叶畸形、叶褶皱、部分黄化、雌花出现雄蕊、雄花无花粉、卷须畸形、植株矮小、生长缓慢、不育等特异性状(图1,1～9)，突变率为18.33%。M1单株人工自交授粉，成熟期单株收获，共得到种子120份。

2.1.2 M2群体突变表型筛选 M1代共得到120份种子，每份种子为1个株系，M2代得到了含有120个株系和1 051个单株的突变体库，共筛选到205个突变植株，40种表型变异。在植株生长过程中，经过观察，在植株主要的农艺性状和生物性状上均发现了突变体，这些性状主要有：子叶黄化、子叶扭曲不对称、子叶折叠等(图2)；叶黄化、叶变小、叶裂刻变深、茎变细、节间变短、分支少等(图3)；花变大、花色变浅、两性花、花瓣皱缩、花瓣部分退化、雄蕊数目增多、柱头畸形、雄蕊不成熟等(图4)；还有整株生长缓慢、不育，总的表型突变率达到了19.59%(表1)。

2.1.3 EMS对西瓜W1-17的变异效应 经过EMS诱变后，与W1-17野生型相比较，连续观察W1-17突变体库M1和M2群体在不同生育时期的表型，部分株系苗期、成熟期都有突变表型，突变表型甚至超过2种。参照《西瓜种质资源描述规范和数据标准》，进行了全面的记录。经过筛选和整理，共获得叶、茎、花、其他等4大类性状的突变体共205份(表1)。W1-17野生型植株表型为：子叶长圆形，子叶、真叶均为绿色，真叶裂刻中等，无褶皱，无蜡质。M2代中叶片的突变频率在几种性状中最高(10.04%)。主要表现有子叶完全黄化、边缘黄化、子叶不对称、叶片变大或变小、叶片裂刻变深或变浅、真叶黄化、叶片褶皱或无蜡质等。突变频率最低的几个性状分别为：子叶半黄化、子叶斑点、叶片裂刻变深、叶片褶皱、节间变长、花色变浅、花冠小等性状，频率低至0.1%。植株茎性状突变表现在茎粗和节间长度的变化。植株花性状突变表现在花冠大小、花瓣畸形、柱头和雄蕊畸形等。另外，还发现6株分支方式变异，14株生长缓慢、长势弱，12株花粉不育等突变类型，初步建立了西瓜W1-17突变体库。

1.植株矮小；2.卷须畸形；3.完全花；4.真叶边缘黄化；5. 叶裂变浅；6. 真叶畸形；7. 真叶失绿；8. 柱头畸形；9. 真叶畸形、叶脉黄化；10.野生型植株；11.野生型雌花；12.野生型雄花图1 M1代部分突变性状(箭头)1. Dwarf plants; 2. Tendril deformity; 3. Perfect flowers; 4. Edge of leaf etiolated; 5. Blade crack moment deepens; 6. Leaf malformation; 7. Leaf chlorosis; 8. Stigma deformity; 9. Leaf malformation, yellow vein; 10. Contrast plant; 11. Contrast female flower; 12. Contrast male flowerFig.1 Partial mutant traits of M1 generation(arrow)

2.2 西瓜M3代典型突变体SSR分析

2.2.1 突变株DNA的提取效果 保留M2代雄蕊不成熟、子叶边缘黄化、矮化株、节间短、叶色变浅、分支变异、柱头变异、叶变小、茎变粗、枯萎病抗性增强这10个典型突变植株的种子，培育获得M3代幼苗后，提取DNA，其DNA用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图5所示，提取的DNA杂质(RNA和蛋白质)较少，提取DNA的浓度和纯度均可用于SSR反应。

2.2.2 突变株在DNA水平上的变异分析 利用23对西瓜SSR引物对9个典型突变植株的DNA进行PCR扩增，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果表明19个引物可以扩增出清晰的条带，其中6条引物扩增出具有多态性的片段，片段多态性可归纳为两种，即DNA片段的增加和缺失。图6是部分引物电泳结果。

1.1片子叶；2.3片子叶；3.子叶完全黄化；4.子叶半黄化；5. 子叶边缘黄化；6. 子叶翅状不对称；7. 子叶扭曲不对称；8. 子叶折叠；9. 子叶双叶脉；10.子叶斑点；11. 子叶边缘黄化；12.野生植株图2 M2代植株子叶性状突变体1. One cotyledon; 2.Three cotyledon; 3. The cotyledons of etiolated; 4. Half yellow cotyledon; 5.Edge of cotyledons etiolated; 6.Cotyledons winged asymmetry; 7.Cotyledons twist asymmetric;8.Cotyledons folded; 9.Cotyledons double veins; 10.Cotyledons spots; 11.Edge of cotyledons etiolated; 12. ContrastFig.2 Cotyledon mutant traits of M2 generation

1. 第一真叶浅黄化；2. 叶脉黄化；3.叶片黄化；4.叶变小；5. 叶片裂刻变深；6. 叶边缘内卷；7 .叶片褶皱；8.茎变细；9.节间变短；10.分支少图3 M2代植株叶和茎性状突变体1. The first leaf light yellow; 2. Yellow vein; 3. Leaf chlorosis; 4. The small leaf; 5. Blade crack moment deepens; 6. Leaf edge involute; 7.Blade fold; 8 .Stem thinning; 9. Shorter internode; 10.Less branchFig.3 Leaf and stem mutant traits of M2 generation

1.花变大；2.花瓣皱缩；3.花瓣分布不匀；4.部分花瓣向下展开；5.花瓣数目突变；6.花色变浅；7.两性花；8.雄蕊原基；9.柱头畸形；10.雄蕊数目变多；11.雄蕊不成熟；12.花瓣部分退化图4 M2代植株花性状突变体1.Bigger flowers; 2.Wrinkled petals; 3.Petals uneven distribution; 4.Part of the petals unfold downward; 5.The number of petals mutation; 6.Color becomes shallow; 7.Hermaphrodite flower; 8.Stamen primordial; 9.Stigma variation; 10.Stamens number increasing; 11.Stamens not mature; 12.Partial degradation of petalsFig.4 Flowers mutant traits of M2 generation

表型Phenotype表型变异株数Phenotypemutationnumber总株数Totalnumberofseeding表型突变率Phenotypemutationrate/%子叶Cotyledon1片子叶Onecotyledon310510．293片子叶Threecotyledon510510．48子叶完全黄化Thecotyledonsofetiolated210510．19子叶半黄化Halfyellowcotyledon110510．10子叶边缘黄化Edgeofcotyledonsetiolated610510．57子叶翅状不对称Cotyledonswingedasymmetry910510．86子叶扭曲不对称Cotyledonstwistasymmetric1210511．14子叶折叠Cotyledonsfolded510510．48子叶双叶脉Cotyledonsdoubleveins210510．19子叶斑点Cotyledonsspots110510．10叶Leaf叶色变浅Leavesturnpale610510．57叶色变深Darkerleafcolor510510．48叶变小Thesmallleaf1110511．05叶变大Largerleaf410510．38叶片裂刻变浅Leaveslobeslighter310510．29叶片裂刻变深Bladecrackmomentdeepens110510．10第一真叶浅黄化Thefirstleaflightyellow710510．67叶脉黄化Yellowvein210510．19叶片黄化Leafchlorosis810510．76叶边缘内卷Leafedgeinvolute810510．76叶片无蜡质Leaveswithoutwax310510．29叶片褶皱Bladefold110510．10茎Stem茎变细Stemthinning810510．76茎变粗Stemsthicken510510．48节间变短Shorterinternode910510．86节间变长Internodelength110510．10花Flower花期早Earlyflowering310510．29花期晚Lateblooming510510．48花冠小Theflowerbecomessmall110510．10花冠大Biggerflowers410510．38花瓣畸形Petalsdeformity1310511．24花色变浅Colorbecomesshallow110510．10两性花Hermaphroditeflower1210511．14柱头畸形Stigmavariation310510．29雄蕊畸形Stamensdeformity410510．38子房变大Ovarylarger310510．29其他Other生长缓慢Slowgrowth1010510．95不育Sterility1210511．14分支方式变异Branchvariation610510．57突变体总数Totalmutants205105119．59

统计后发现，雄蕊不成熟突变株在242～238和217 bp处各缺失1条条带，分支变异突变株缺失了1条大约217的片段和1条242～238 bp片段，节间短突变株在201 bp和190～180 bp处增加了2条条带；叶变小突变株则缺失1条大小为527～404 bp片段，矮化株增加大小为404～309 bp片段，茎变粗和枯萎病抗性增强突变株都增加了1条190 bp片段，子叶边缘黄化突变株缺失1条404～309 bp片段，叶色变浅突变株则同时增加1条160 bp片段，又缺失1条190 bp片段(表2)。由于分子标记不受环境及其他因素的影响，扩增出来的多态性片段能较真实地反映出不同性状变异株在分子水平上的差异，推测在不同染色体组的DNA某一片段上确实存在着基因突变。

M. Marker; 1～10. DNA图5 M2群体DNAFig.5 DNA of M2 group

M.分子量标准；1.野生型；2.雄蕊不成熟；3.子叶边缘黄化；4.矮化株、5.节间短；6.叶色变浅；7.分支变异；8.柱头变异；9.叶变小；10.茎变粗；11.枯萎病抗性增强图6 引物BVWS00048(A)、BVWS00658(B)和BVWS00106(C)扩增结果M.Marker;1.Contrast;2.Stamens immature; 3.Cotyledon edge yellowing; 4.Dwarfing plants;5. Short internodes; 6.Lighter leaf color; 7.Branch variation; 8.Stigma variation; 9.Leaf smaller; 10.Stem thickening; 11.Fusarium wilt resistance enhancementFig.6 Amplified results of primer BVWS00048(A),BVWS00658(B) and BVWS00106(C)

突变体 Themutant 引物编号PrimerNo．缺失片段Thefragmentofdeletion/bp增加片段Thenewfragment/bp染色体位置Chromosomelocation雄蕊不成熟StamensimmatureBVWS00155242～238；2171分支变异BranchvariationBVWS00155242～238；2171节间短ShortinternodesBVWS00314201；190～1802叶变小LeafsmallerBVWS00048527～4043矮化DwarfingplantsBVWS00209404～3099枯萎病抗性增强FusariumwiltresistanceenhancementBVWS001061903茎变粗StemthickeningBVWS001061905子叶边缘黄化CotyledonedgeyellowingBVWS00209404～3099叶色变浅LighterleafcolorBVWI001701901607

3 讨 论

3.1 西瓜突变体库的构建

3.1.1 西瓜遗传背景和EMS诱变的优点 由于特殊种质资源缺乏、遗传背景狭窄导致西瓜相关功能基因组学研究进展缓慢。随着生物信息学的发展，出现越来越多的方法分析和发掘功能基因，通过构建突变体库来精确目标基因功能是其中最有效的方法。在蔬菜中，EMS是应用最广且副作用最小的诱变剂，它用于农作物诱变育种，并在油菜[27]，番茄[28]等多数农作物中取得重大成就。目前还没有创建大规模西瓜突变体库的报道，其最重要的原因在于下述四个方面：第一，采用基于农杆菌转化技术的T-DNA 插入法是构建突变体库的最广泛、最成熟的方法，但对西瓜进行大规模的转基因研究，不仅操作困难，而且转化率低；第二，西瓜生长周期长，在中国西瓜通常只能种植两季；第三，西瓜单株种植面积大，因此很少有研究小组能利用大型种植区域进行大规模突变体库的创建；第四，西瓜是雌雄同株异花植株，需要人工授粉，工作量大。

本研究利用 EMS 诱变技术进行西瓜突变体库的初步研究，以下三点是其主要原因。第一，操作方法简单，投入成本少。EMS处理材料无需大型仪器，一次就能诱变大量的材料，诱变效果较好。通常，利用EMS诱变植物材料种子，可通过后代自交的方法而得到可遗传的变异类型。第二，EMS 产生突变的密度高，可以使得一个单株含有大量的突变位点，所以无需大量植株就可使突变位点涵盖全基因组。第三，EMS诱变不会渗入外源基因，能够使突变材料直接应用于遗传育种中，消除了转基因技术给人类带来的安全问题[29]。

随着基因测序技术的发展，在通过高通量测序手段对全基因组进行比较分析的条件下，学者们已创建了玉米[30]、黄瓜[31]、白菜[32]等植物的不饱和突变体库，加快了其相关遗传学、分子生物学等领域的研究步伐。本研究采用EMS诱变和SSR分子分析相结合的方法，筛选部分突变体，初步创建了突变体库。但是本实验创建西瓜突变群体数量较少，今后还需要进一步构建数量更大的西瓜突变体库。

3.1.2 突变材料的发掘 理化诱变时，多会导致幼苗白化现象和黄化现象，两者的频率都不低，说明两种突变体是较容易产生的类型。Jung等[33]使用T-DNA插入筛选白化水稻突变体，并成功分离出该白化基因，推测该基因可能涉及Mg鳌合酶合成，通过酶合成来控制水稻叶绿素的生物合成。已有研究表明叶色突变基因可以直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变突变体中的叶绿素含量，引起光合效率下降，严重时甚至导致植株死亡[34]。本试验筛选得到黄化苗突变体，是否存在等位突变，对叶绿素的产生机制还需要进一步研究。

株高是高等作物的重要农艺性状之一，如若植物的高度同大多数野生西瓜一样过于高大则容易造成营养生长过盛导致减产，而矮生植株高产、便于实现机械化管理，所以选育矮化株是西瓜重要的育种目标，了解和探索矮化基因也成为重要的研究目标。由于株高受环境影响较明显，所以不排除发现的矮化材料其实是由环境因素造成的可能性，需要经过后代进一步鉴定。本试验中发现了节间长度明显短于对照，且整株成熟期高度不足1 m的矮化植株9株，并对其中1个株系进行了SSR鉴定。由于其他矮化突变体极难自交授粉，本研究通过杂交留下后代，可供以后进一步研究。

3.2 突变体表型性状的鉴定

3.2.1 环境因素对突变表型性状鉴定的影响 研究者对突变材料进行田间性状调查的时候，易受环境因素的影响，将受病原菌侵染和水肥管理等栽培条件影响所产生的变异性状归属于由EMS诱变产生的变异性状，所以明确该性状是否是诱变导致的变异则显得尤为重要。本研究将同一株系所种植的单株中3株都出现同一变异性状归为可遗传变异，少于3株的变异性状则需对比M1代调查结果来看是否是可遗传变异。

3.2.2 西瓜突变体筛选方法 突变体鉴定方法中最常用的是表型鉴定，但调查结果易受到环境等因素的影响，只从田间表型来判断是否是可遗传的突变是不行的。细胞学和生理生化鉴定虽然能从染色体变化、蛋白质含量变化等方面对突变植株进行研究，从而进一步推测遗传变异发生的可能，但常常受到方法和鉴定指标的限制。分子标记技术可以从基因水平上直接揭示材料之间的差异，操作简单，稳定性好，本试验采取SSR检测的方法鉴定西瓜突变体。

本试验选择SSR标记鉴定的好处在于它是从DNA水平上检验突变体的变化，它可以在植株的任一部位、任一时期进行检测，不受外界因素的影响。无论从质量还是含量上，SSR标记对所提取的DNA要求不高，且是共显性遗传，多态性好，数目众多，能够遍布全基因组[35]。利用SSR分子标记进行鉴定，可以在分子水平上进行验证突变体的真实性。

本试验使用的是西瓜23对核心SSR引物，对10份突变体株系进行分析，发现有9株突变株与对照有差异，其余植株则没有差异。差异的结果有2种，片段的有无差异和片段长度的差异，前者可能是由于EMS点突变产生的碱基对颠换、转换导致的[36]，后者可能是由于EMS诱变另一机理：甲基磺酸乙酯和核苷结构的磷酸发生反应产生磷酸酯，导致糖-磷酸骨架的断裂，这一变化可产生缺失突变和插入突变，引起DNA 链长度的改变，最终导致差异条带长度的变化[37]。该试验结果证明，部分突变株在DNA水平发生改变，这为突变体的形成提供了充分的证据。但本研究只是对突变个体的初步鉴定，突变的性状是否纯合，突变基因能否遗传，以及基因突变位点和基因对应的性状，都还需进一步研究了解。另外，试验中突变体的差异位点较低，可以寻找附近位点基因和寻找新的基因用于功能基因分析的探索[38]。

综上所述，本试验初步构建了含有120个M1代家系及1 051株M2代植株的西瓜突变体库。M2代得到了40种不同的变异类型，总变异频率达19.59%。针对典型变异植株，使用23对SSR引物进行分析，发现9份材料在DNA水平上有变异。下一步将进行M3代田间表型筛选，除了进行正向遗传学外，还将利用Tilling等反向遗传学技术在突变体库中筛选与鉴定与重要目标性状相关的基因。

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(编辑:裴阿卫)

Construction of EMS Mutagenesis Watermelon Mutant Library and Phenotypic Analysis

HOU Yan1,2，ZHU Zicheng1,2, ZHU Nana1,2,CHEN Kenong1,2,LUAN Feishi1,2，WANG Xuezheng1,2*

(1 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in Northeast China，Harbin 150030，China; 2 Horticulture College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The watermelon strain W1-17 was treated with ethylmethanesulfonate (EMS) at 1.0% for 9 h, and phenotypic variation of M1and M2,including the leaf, flower, stalk, fertility and branching habits etc, were studied. The typical mutant lines of M2were selected simultaneously, and 23 watermelon SSR primers were used for analysis and identification, and the mutant library of watermelon was constructed finally. The results showed that: (1) the M1seedlings mutagenized showed differently morphological characteristics such as leaf deformity, leaf folds, partial yellowing, floral abnormality, male flowers do not loose powder, tendril deformity, short stature, slow growth and infertility, ect. The M1population of watermelon mutant was composed of 1 252 individual plants, the total mutation frequency was 18.33%.(2) 205 M2mutant plants were screened, and 40 phenotypic variations were found in cotyledon traits (yellowing, asymmetric twist, fold etc.), leaf and stem traits (leaf yellowing, smaller, cracked deep, thin stems, internodes shorter, less branched and so on), floral traits (flowers become larger, lighter color, bisexual flowers, petals shrinkage, partial degradation, the number of mutations, stigma deformities, stamens immature) ,and other traits (slow growth, infertility, etc.), the total phenotypic mutation rate reached 19.59%. (3) For the 10 representative mutant plants of M2generation, 9 samples were found to be mutated at the DNA level by SSR primer analysis. In this study, a mutant library of watermelon containing 120 M1generation lines and 1051 M2generation plants and 40 phenotypic variations was constructed.

watermelon; ethylmethanesulfonate (EMS) mutagenesis; mutant library; SSR

1000-4025(2016)12-2411-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2411

2016-10-10;修改稿收到日期:2016-11-29

黑龙江省科技攻关项目(GC13B109)；国家西甜瓜产业技术体系项目(CARS-026-02)

侯 艳(1991-)，女，在读硕士研究生，主要从事西甜瓜种质资源创新研究。E-mail：330829426@qq.com

*通信作者:王学征，教授，硕士生导师，主要从事西甜瓜遗传育种研究。E-mail：xz6206815@163.com

Q813.5;Q789

A